【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种具有普适性的提取微生物dna的试剂盒及方法与应用。
技术介绍
1、病菌感染一直以来影响人身体健康的重大问题，近年来，随着各种病症问题不断普及，人们对病菌感染的认知也越来越广泛。大多数疾病的发生都和细菌、真菌有密切关系，然而传统的检测方法如：通过增菌、分离培养、生化反应与血清凝集等检测方法已经远不能满足现代社会快速检测的要求。实时荧光定量pcr技术具有特异性强、稳定性好、灵敏度高、检测速度快等优点在医疗临床检测领域得到广泛的应用，其中模板dna的提取是其中的重要步骤之一，如何快速提取dna模板是提高实时荧光定量pcr法检测灵敏度和速度的关键。
2、目前，dna的提取方法有很多，主要有物理提取法、化学提取法、滤膜离心柱法和磁珠法等。物理提取法有研磨和高温加热法，若强度过于激烈，容易破坏dna双链，若强度不足，对于细菌来说研磨并不能有效的破坏细胞结构，难以保证细胞结构裂解充分；化学提取法包括ctab法、sds法和苯酚氯仿抽提法等，化学提取法操作方法成熟，但化学提取法dna操作繁琐、需要多次转移，耗时长，易损失，并且苯酚氯仿抽提法在提取过程中需要使用氯仿等有机毒溶剂，对人体伤害险较大；滤膜离心柱法提取效果稳定，操作速度快，但是需要多次转移液体，对于含糖物质较多的真菌和小片段dna提取效率不高。
3、此外，研磨、离心、多次转移反应液、滤膜离心柱等需人工操作步骤，不利于自动化设备的实施，不易适用于自动化提取流程，提取通量小，人工个体间操作误差大，人工成本高，所以难以适应高效的
4、目前市场上常规试剂盒对于每种真菌的细胞膜和细胞壁有不同的处理方式和方法，常常是单一提取试剂盒对应单一种类的真菌，提取种类通量小，对于其他真菌的核酸提取，提取效率和灵敏度有明显的下降甚至无法提取。对于有着复杂成分的血液、痰液样本，常规提取试剂盒不能有效的对样本中微量细菌和真菌进行dna的提取，或者多菌复合感染中不能对全部的微生物进行dna的提取，容易造成误检、漏检。
5、因此，为了适应于医疗机构和检测机构样品量大的特点，专利技术一种普适性的提取微生物dna的试剂盒及方法与应用，其具有检测微生物种类高通量、高灵敏度、低风险低污染、经济实惠、步骤简捷可适用于自动化流程，有着重大意义。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有普适性的提取微生物dna的试剂盒。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种具有普适性的提取微生物dna的方法，采用上述试剂盒实现。该方法通过物理法、化学法和酶法提取dna的方法，解决了传统物理提取法对dna结构破坏的问题；解决了传统化学提取法的缺点，不使用有毒和有污染的试剂；并且能从超微量微生物中提取dna，大大的提高了提取的灵敏度；使用简便可适用于自动化设备、降低人工成本经济实惠、减少人为误差。
3、本专利技术的再一目的在于提供上述试剂盒和方法的应用。
4、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
5、一种具有普适性的提取微生物dna的试剂盒，包括预处理液、酶解液、裂解液、磁珠提纯液、洗脱液和保护液；其中：
6、预处理液的组成如下：皂苷0.1～1mg/ml、氢氧化钠0.2～1mol/l、氯化钾0.05～0.1mol/l，ph 11～13；优选如下：皂苷0.5mg/ml、氢氧化钠0.5mol/l、氯化钾0.05mol/l，ph13；
7、酶解液的组成如下：tris 10～30mmol/l、edta 0.2～2mmol/l、nacl 0.01～0.15mol/l、曲拉通x-100 0.1～3％(v/v)、聚乙二醇35000 1～8％(w/v)、海藻糖0.1～1mol/l、rna酶a 0.1～0.5mg/ml、溶菌酶1～10mg/ml、蜗牛酶1～10mg/ml，ph6.0～8.0；优选如下：tris 20mmol/l、edta 1mmol/l、nacl 0.1mol/l、曲拉通x-100 1％(v/v)、聚乙二醇350005％(w/v)、海藻糖0.5mol/l、rna酶a 0.2mg/ml、溶菌酶5mg/ml、蜗牛酶5mg/ml，ph7.5；
8、裂解液的组成如下：tris 10～30mmol/l、edta 0.2～2nmol/l、曲拉通x-100 0.1～3％(v/v)、氯化钠0.5～1mol/l、蛋白酶10～30mg/ml，ph6.0～8.0；优选如下：tris25nmol/l、edta 1nmol/l、曲拉通x-100 1％(v/v)、氯化钠0.8mol/l、蛋白酶20mg/ml，ph7.5；
9、磁珠提纯液的组成如下：磁性纳米四氧化三铁4～6mg/ml，溶剂为异丙醇；优选如下：磁性纳米四氧化三铁5mg/ml，溶剂为异丙醇；
10、洗脱液为浓度是75～85％(v/v)的异丙醇；优选为80％(v/v)的异丙醇；
11、保护液为te溶液。
12、所述的rna酶a优选60u/mg的rna酶a。
13、所述的溶菌酶优选2000u/mg的溶菌酶。
14、所述的蜗牛酶优选10mg/ml的蜗牛酶。
15、所述的蛋白酶优选20u/mg的蛋白酶。
16、所述的四氧化三铁颗粒优选直径为30～60纳米的磁性四氧化三铁颗粒；更优选直径为50纳米的磁性四氧化三铁颗粒。
17、所述的te溶液的组成如下：50mm tris-hcl、1mm edta，ph8.0。
18、一种具有普适性的提取微生物dna的方法，使用上述试剂盒提取微生物dna，包括如下步骤：
19、(1)取1～5ml的样品，加入等量预处理液反应，离心，倒去上清，尽量吸干可见残留液体；得到的沉淀烘干；
20、(2)加入100μl酶解液，涡旋振荡混匀，进行酶解反应；
21、(3)加入250μl裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，进行裂解反应；
22、(4)加入350μl磁珠提纯液，涡旋混匀，进行吸附反应，反应后弃上清；
23、(5)用1ml洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清；重复清洗沉淀，将所得沉淀烘干；
24、(6)加入30μl保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀，即得到微生物dna。
25、步骤(1)中所述的反应的条件优选为36～38℃反应5～15min；更优选为37℃反应10分钟。
26、步骤(1)中所述的离心的条件优选为10000～15000rpm离心1～5min；更优选为14000rpm离心2分钟。
2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于：包括预处理液、酶解液、裂解液、磁珠提纯液、洗脱液和保护液；其中：
2.根据权利要求1所述的具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于：所述的预处理液的组成如下：皂苷0.5mg/mL、氢氧化钠0.5mol/L、氯化钾0.05mol/L，pH 13；
3.根据权利要求1或2所述的具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于：
4.一种具有普适性的的提取微生物DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
8.权利要求1～3任一项所述的试剂盒或权利要求4～7任一项所述的方法在微生物DNA提取中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的微生物包括细菌和真菌。
【技术特征摘要】
1.一种具有普适性的提取微生物dna的试剂盒，其特征在于：包括预处理液、酶解液、裂解液、磁珠提纯液、洗脱液和保护液；其中：
2.根据权利要求1所述的具有普适性的提取微生物dna的试剂盒，其特征在于：所述的预处理液的组成如下：皂苷0.5mg/ml、氢氧化钠0.5mol/l、氯化钾0.05mol/l，ph 13；
3.根据权利要求1或2所述的具有普适性的提取微生物dna的试剂盒，其特征在于：
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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡伟文，范世睿，黄亦杭，
申请(专利权)人：中山康源基因技术科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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