一种Oligo探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种Oligo探针及其制备方法与应用。本发明专利技术通过将第一部分序列和第二部分序列混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针；其中，第一部分序列是共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端形成；第二部分序列是共同序列2连接在标记序列的3’端形成；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补。该Oligo探针具有较高的灵敏性和特异性，可用于制备FISH探针，得到的FISH探针易于进入细胞，杂交反应快速，利用特定的杂交缓冲液，可缩短杂交时间至1‑2h。

【技术实现步骤摘要】
一种Oligo探针及其制备方法与应用
本专利技术涉及供FISH技术用的核酸探针制备与标记的方法，特别涉及一种Oligo探针及其制备方法与应用。
技术介绍
通过使用核酸探针，如带有某种标记的DNA或RNA探针，从而在细胞水平或染色体水平探测和显示染色体结构异常及基因表达异常，这非常的直观展现许多生命体基因层面的问题。这种可视化的技术被称为原位杂交(ISH)，而其使用的探针标记方法可大致分为“放射性同位素标记法”和“荧光素标记法”，由荧光素代替放射性同位素在标记探针上的应用，逐步发展起来的荧光原位杂交技术(FISH)具有经济、安全、快速、稳定等特点，目前，广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体亚微结构变异分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等诸多领域。其原理是用已知序列并标记了的核酸为探针，基于碱基互补配对原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测到的杂交双链核酸，根据不同的检测目的，探针可分为DNA探针和RNA探针。利用标记好的核酸探针对特定核酸进行杂交检测的方法，其检测的效果的好坏取决于核酸探针的设计及其标记效果的优劣。随着人类基因组计划的完成，原则上我们可以设计检测任何基因的核酸探针，多种荧光素的开发成功以及与酶联免疫技术的结合使得核酸探针标记与检测结果可视化取得重大突破，该技术得到快速发展，在基础生命科学研究与疾病诊断方面均得到广泛应用。通过设计不同的核酸探针，可用于染色体数目分析、基因拷贝数分析以及基因表达量分析，使得检测微小复杂的染色体变异成为可能。近年发展起来的多色荧光原位杂交(M-FISH)和光谱核型分析(SKY)正是利用多种荧光染料标记的核酸探针对待测材料同时进行检测分析，提高了检测的通量与灵敏度。目前，核酸探针的制备与标记主要可分为化学直接合成法和以人工染色体为基础各种标记方法，前者是在合成核酸序列时将标记物直接加到探针序列上，而后者则可通过PCR法、切口平移法、末端标记法或随机引物法将标记物掺入探针序列中达到探针的制备与标记的目的。化学法合成核酸探针，可根据需要任意掺入标记物，具有高特异性，高灵敏度，但合成一个带特定标记的探针的价格是只简单合成核酸序列的10～100倍，而检测一个基因需要成千上百个标记的探针，价格昂贵，随着探针数量及待检基因数的增加，其成本高，一般单位机构或个人难以承受；且直接带有荧光素或其他抗体等标记物的核酸探针，不能长久保存。其他探针制备标记技术，也都各有自身的缺陷，如PCR技术和随机引物法受限于探针产量，其探针的得率低；末端平移法则受限于掺入的标记物，标记物只掺入到探针序列的有限部位，需辅以其他信号放大技术。另有PCR法制备无重复序列的高灵敏度核酸探针的方法，其反应底物中混有带标记的脱氧核苷酸，通过DNA聚合酶将带标记的脱氧核苷酸插入到核酸探针序列中，这种标记探针本身序列的方式容易影响探针的特异性且随着加入的标记脱氧核苷酸增多不利于探针的扩增，同时PCR法标记核酸探针的体系复杂，影响产物得率的因素多，每个反应都需设计特定的引物，并调试程序，还需对产物进行纯化和鉴定，制备过程繁琐。例如，专利CN100590201C说明书所公开的那样通过调整PCR法标记探针的体系，来提高标记物掺入量来达到更优的标记效果，但由于其直接标记探针序列的脱氧核苷酸，这受限于探针序列，不同的探针序列标记效果不尽相同，针对不同的探针序列，要达到比较理想的标记效果需对标记的脱氧核苷酸进行选择，保证最优。该方法严重依赖探针序列，推广到大量基因的探针制备有一定阻碍。其次，相对合成法制作探针可对探针序列进行特定的选择，传统的核酸探针还存在重复序列的问题，探针中重复序列的存在，增加后续应用于杂交时的复杂程度，探针量之间通过重复序列结合，大大降低探针的可用量，也不利于双色甚至多色探针的应用。目前，对大量的基因进行FISH检测，急需一种快速高效且价格低廉的探针制备与标记方法，它要能具有高特异性，能与待测基因或位点进行特异性结合，同时能兼具FISH技术的操作方便，结果直观，可视化效果好且价格适中，适用于不同基因的检测且结果稳定可靠。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高灵敏度、高特异性、价格适中、且标记不受探针序列影响，易于推广至检测任意基因的Oligo探针的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的Oligo探针。本专利技术的再一目的在于提供上述Oligo探针在制备FISH探针中的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种用于荧光原位杂交的试剂盒。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种Oligo探针的制备方法，包括如下步骤：(1)Oligo探针序列的设计：Oligo探针的结构包括特异寡核苷酸序列、共同序列1、共同序列2和标记序列；其中，共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端，得到第一部分序列；共同序列2连接在标记序列的3’端，得到第二部分序列；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补；(2)Oligo探针的制备：将第一部分序列和第二部分序列按一定摩尔比例混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针。步骤(1)中所述的共同序列1的长度优选为6～12bp。步骤(1)中所述的共同序列2的长度优选为6～12bp。步骤(1)中所述的标记序列是用于标记的自定义序列，是与待测基因不能完全匹配的序列。为保证荧光强度足够，以dUTP为例，所述的自定义序列中碱基A的占总标记序列碱基的比例>25％、且与待测基因不能完全匹配。步骤(1)中所述的标记序列的长度优选为30～150bp。步骤(1)中所述的修饰可以是氨基修饰、巯基修饰或磷酸化修饰。步骤(2)中所述的摩尔比例优选为第一部分序列和第二部分序列的摩尔比为1:1～2；更优选摩尔比为1：1.5。步骤(2)中所述的脱氧核糖核苷酸为dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP中的至少一种。步骤(2)中所述的标记优选为荧光素标记或易于与荧光素反应的基团。所述的易于与荧光素反应的基团优选为氨基。所述的荧光素标记优选为Cy3或6-FAM。步骤(2)中所述的体系中优选含有dATP、dCTP、dGTP、NH2-dUTP；更优选含有0.2mMdATP、0.2mMdCTP、0.2mMdGTP、0.1mMNH2-dUTP。步骤(2)中所述的变性的条件优选为90～100℃反应30～60秒。步骤(2)中所述的退火的条件优选为冰浴2min后转入4℃放置10min。步骤(2)中所述的聚合酶优选为大肠杆菌DNA聚合酶I大片段、BstDNA聚合酶大片段或BsuDNA聚合酶大片段。步骤(2)中所述的聚合反应的条件优选为于25℃～65℃反应；更优选为28～37℃反应45～75min。一种Oligo探针，通过上述制备方法得到。所述的Oligo探针在制备FISH探针中的应用。一种FISH探针，通过如下步骤制备得到：①当所述的Oligo探针中的标记是荧光素时，所述的Oligo探针即为FISH探针；②当所述的Oligo探针中的标记是易于与荧光素反应的基团时，将所述的Oligo探针与荧光素染料混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Oligo探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)Oligo探针序列的设计：Oligo探针的结构包括特异寡核苷酸序列、共同序列1、共同序列2和标记序列；其中，共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端，得到第一部分序列；共同序列2连接在标记序列的3’端，得到第二部分序列；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补；(2)Oligo探针的制备：将第一部分序列和第二部分序列按一定摩尔比例混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针。

【技术特征摘要】
1.一种Oligo探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)Oligo探针序列的设计：Oligo探针的结构包括特异寡核苷酸序列、共同序列1、共同序列2和标记序列；其中，共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端，得到第一部分序列；共同序列2连接在标记序列的3’端，得到第二部分序列；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补；(2)Oligo探针的制备：将第一部分序列和第二部分序列按一定摩尔比例混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针。2.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的共同序列1的长度为6～12bp；步骤(1)中所述的共同序列2的长度为6～12bp；步骤(1)中所述的标记序列的长度为30～150bp；步骤(1)中所述的修饰为氨基修饰、巯基修饰或磷酸化修饰。3.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的摩尔比例是第一部分序列和第二部分序列的摩尔比为1:1～2。4.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的脱氧核糖核苷酸为dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP中的至少一种；步骤(2)中所述的标记为荧光素标记或易于与荧光素反应的基团；步骤(2)中所述的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I大片段、BstDNA聚合酶大片段或BsuDNA聚合酶大片段。5.根据权利要求4所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：所述的易于与荧光素反应的基团为氨基；所述的荧光素标记为Cy3或6-FAM。6.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡伟文，邓佳，颜飞地，
申请(专利权)人：中山康源基因技术科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44