具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其在生产氨基酸中的应用制造技术

本公开涉及具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其在生产氨基酸中的应用。具体来说，本公开涉及一种新的具有天冬氨酸激酶活性的多肽、重组多肽、多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，以及生产氨基酸的方法。本公开的具有天冬氨酸激酶活性的多肽是在在对应于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第293、294和307位的一个或多个位置处发生突变的突变体，与SEQ ID NO：1所示序列的多肽相比，突变体多肽解除了赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，具有高的天冬氨酸激酶活性，能够用于赖氨酸及其衍生物的稳定、高效生产。

【技术实现步骤摘要】
具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其在生产氨基酸中的应用
本公开属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，以及生产氨基酸的方法。
技术介绍
赖氨酸(lysine)的化学名称是2,6-二氨基庚二酸，是动物和人体必需氨基酸，能促进人体发育、增强免疫能力，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋型)三种化学旋光异构体，其中只有L型才能为生物所利用，通常所说的赖氨酸即为L-赖氨酸。赖氨酸在人类主食谷物食品中的含量较低，缺乏会引起蛋白质代谢及功能障碍，对生长造成不利影响，并且在加工过程中容易被破坏，故被称为第一限制性氨基酸，在医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。目前为止，工业上生产赖氨酸的方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产赖氨酸应用最广泛的方法。棒状细菌和埃希氏菌在赖氨酸的工业化生产中获得了广泛应用，常用的埃希氏菌如大肠杆菌(Escherichiacoli)，常用的棒状细菌有棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，短杆菌属的黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentus)，以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。而由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，谷氨酸棒杆菌已成为工业中最重要的生产菌株。谷氨酸棒杆菌中同时存在脱氢酶途径和琥珀酰化酶途径两种赖氨酸的生物合成途径。其中，谷氨酸棒杆菌利用脱氢酶途径合成赖氨酸有6个酶催化反应，分别是天冬氨酸激酶(AK，由基因lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(ASADH，由基因asd编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS，由基因dapA编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(DHDPR，由基因dapB编码)、二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH，由基因ddh编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(DAPDC，由基因lysA编码)。谷氨酸棒杆菌利用琥珀酰化酶途径合成赖氨酸的过程中还涉及合成内消旋二氨基庚二酸的四种酶：琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(由基因dapD编码)，四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶(由基因dapC编码)，琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶(由基因dapE编码)及二氨基庚二酸差向异构酶(由基因dapF编码)。其中，天冬氨酸激酶催化L-天冬氨酸生成天冬氨酸磷酸，是谷氨酸棒杆菌中L-天冬氨酸生物合成途径的第一步，也是赖氨酸生产的限速步骤，天冬氨酸激酶的活性受赖氨酸的反馈抑制[1]。因此，如何解除赖氨酸生物合成途径中赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，对于选育赖氨酸的高产菌株具有重要意义。引用文献1公开了一种对赖氨酸抑制不敏感的天冬氨酸激酶的突变体，其对分离于大肠杆菌中的天冬氨酸激酶III(AspartatekinaseIII，AKIII)的编码基因进行随机突变，筛选得到了两种解除反馈抑制的AKIII突变体，分别是将352位苏氨酸用异亮氨酸替换(T352I)和318位甲硫氨酸用异亮氨酸替换(M318I)。虽然两种AKIII突变体可以解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，但其应用于赖氨酸生产的效率不高，无法获得赖氨酸产量显著提升的赖氨酸高产菌株。引用文献2公开了谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶突变体，包括279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I和S381F。上述的AKIII突变体虽然可解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，但应用于赖氨酸生产的效率差别较大，其中T311I是目前所有文献报道的应用于赖氨酸生产效果最好的突变体，可显著提升菌株的赖氨酸产量。能否获得解除赖氨酸反馈抑制且赖氨酸生产效果更高的天冬氨酸激酶突变体是本领域技术人员急需解决的问题。引用文献：引用文献1：EP1394257引用文献2：EP1590463A2
技术实现思路
专利技术要解决的问题鉴于现有技术中存在的问题，例如，天冬氨酸激酶的突变体无法稳定、高效生产赖氨酸的缺陷。为此，本公开提供了一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽，是野生型天冬氨酸激酶的突变体。与野生型的天冬氨酸激酶相比，本公开的突变体解除了赖氨酸对天冬氨基酸激酶的反馈抑制，具有高的天冬氨酸激酶活性，能够稳定、高效地生产赖氨酸。用于解决问题的方案(1)一种多肽，所述多肽具有天冬氨酸激酶活性，其中，所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：(i)具有如SEQIDNO：1所示序列的多肽的突变体，所述突变体和SEQIDNO：1所示的序列相比，在对应于SEQIDNO：1所示序列的至少第293、294和307位中的一个或多个位置处包含突变；(ii)与(i)所示序列具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性，且不包括SEQIDNO：1所示序列的多肽；(iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：(a)编码如(i)所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)(a)的全长互补多核苷酸；(iv)由(i)、(ii)、(iii)所示的多肽的片段，并且所述片段仍然具有天冬氨酸激酶活性。(2)根据(1)所述的多肽，其中，所述多肽为包含如下(c)-(e)中至少一组所示的突变的多肽：(c)对应SEQIDNO：1所示序列的第293位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)或精氨酸(R)；(d)对应SEQIDNO：1所示序列的第294位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；(e)对应SEQIDNO：1所示序列的第307位的氨基酸由苏氨酸(T)突变为酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)或苯丙氨酸(F)。(3)根据(1)或(2)所述的多肽，其中，所述多肽包括在(i)所示序列的多肽的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。(4)一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括(1)-(3)任一项所述的多肽，以及与所述多肽融合的外源多肽；可选地，所述外源多肽包括标签多肽；优选地，所述外源多肽包括标签多肽，以及连接所述标签多肽与所述具有天冬氨酸激酶活的多肽的间隔多肽。(5)一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码(1)-(3)任一项所述多肽的核苷酸序列，或包含编码(4)所述重组多肽的核苷酸序列。(6)一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含(5)所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。(7)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含(5)所述的多核苷酸，或(6)所述的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，所述多肽具有天冬氨酸激酶活性，其中，所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：/n(i)具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽的突变体，所述突变体和SEQ ID NO：1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO：1所示序列的至少第293、294和307位中的一个或多个位置处包含突变；/n(ii)与(i)所示序列具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性，且不包括SEQID NO：1所示序列的多肽；/n(iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：/n(a)编码如(i)所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；/n(b)(a)的全长互补多核苷酸；/n(iv)由(i)、(ii)、(iii)所示的多肽的片段，并且所述片段仍然具有天冬氨酸激酶活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种多肽，所述多肽具有天冬氨酸激酶活性，其中，所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)具有如SEQIDNO：1所示序列的多肽的突变体，所述突变体和SEQIDNO：1所示的序列相比，在对应于SEQIDNO：1所示序列的至少第293、294和307位中的一个或多个位置处包含突变；
(ii)与(i)所示序列具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性，且不包括SEQIDNO：1所示序列的多肽；
(iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
(a)编码如(i)所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)(a)的全长互补多核苷酸；
(iv)由(i)、(ii)、(iii)所示的多肽的片段，并且所述片段仍然具有天冬氨酸激酶活性。


2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽为包含如下(c)-(e)中至少一组所示的突变的多肽：
(c)对应SEQIDNO：1所示序列的第293位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)或精氨酸(R)；
(d)对应SEQIDNO：1所示序列的第294位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
(e)对应SEQIDNO：1所示序列的第307位的氨基酸由苏氨酸(T)突变为酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)或苯丙氨酸(F)。


3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，所述多肽包括在(i)所示序列的多肽的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。


4.一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括权利要求1-3任一项所述的多肽，以及与所述多肽融合的外源多肽；可选地，所述外源多肽包括标签多肽；优选地，所述外源多肽包括标签多肽，以及连接所述标签多肽与所述具有天冬氨酸激酶活的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，刘娇，王钰，周文娟，孙际宾，陈久洲，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12