提高转录的RNA的加帽效率的方法和组合物技术

提供了用于将体外转录(IVT)混合物中的RNA加帽的方法和组合物，所述混合物包括热稳定的RNA聚合酶变体和帽类似物，使得当将DNA模板添加到混合物中，然后将混合物在用于体外转录的条件下温育时，产生了加帽的RNA。方法描述了在升高的温度下以及在用于IVT的标准温度下的高加帽效率。所使用的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶的热稳定变体，称为聚合酶M20，其包括在388和567位处的取代，特别是D388E和V567P。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高转录的RNA的加帽效率的方法和组合物
技术介绍
真核mRNA在其5'-末端具有帽结构。该帽由7-甲基鸟苷(m7G)和三磷酸桥ppp(p3)组成，该桥将m7G的5'OH与5'-末端核苷酸N的5'OH连接，表示为m7G(5')pppN(m7G(5')p3N)(Cap0结构)。帽结构赋予被加帽的RNA多种生物学功能(Ramanathan等人，(2016)NucleicAcidsResearch，44，7511-7526)。这些功能包括mRNA加工和运输；赋予mRNA分子稳定性；提高翻译效率；和加速mRNA与细胞机器(包括翻译装置、免疫受体和效应器)之间的多重相互作用。经由体外转录(IVT)合成的RNA可以在转录反应期间(在称为“共转录加帽”的过程中)或其之后(即，转录后使用一系列酶促步骤)加帽(例如，参见Muttach等人，J.OrgChem.(2017)13：2819–2832)。在共转录加帽中，IVT反应中包括帽类似物以及四个核糖核苷三磷酸。帽类似物是N7-甲基化鸟苷三磷酸帽的合成类似物，并且可以向RNA添加天然或非天然的帽(参见Muttach，见上文)。然而，共本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在体外转录反应中将RNA加帽的方法，其包括：/n(a)将rNTP、DNA模板、帽类似物和RNA聚合酶组合以产生反应混合物，所述RNA聚合酶包含：(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ IDNO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和/n(b)在适合于DNA模板的体外转录的条件下温育所述反应混合物以产生所述模板的加帽的RNA拷贝。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181004 US 62/741,1111.一种用于在体外转录反应中将RNA加帽的方法，其包括：
(a)将rNTP、DNA模板、帽类似物和RNA聚合酶组合以产生反应混合物，所述RNA聚合酶包含：(i)与SEQIDNO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQIDNO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和
(b)在适合于DNA模板的体外转录的条件下温育所述反应混合物以产生所述模板的加帽的RNA拷贝。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述帽类似物具有下式：



其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同；
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。


3.根据权利要求1所述的方法，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述帽类似物是二核苷酸帽类似物或三核苷酸帽类似物。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶包括在对应于SEQIDNO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQIDNO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQIDNO：1的109、205、534和618位的至少两个或三个位置的氨基酸取代。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶包括在对应于SEQIDNO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶包括与SEQIDNO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加帽效率大于95％。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的温育进一步包括：在至少30℃至约70℃的温度下执行体外转录。


12.一种组合物，其包括：
rNTP、帽类似物和RNA聚合酶，所述RNA聚合酶包括：(i)与SEQIDNO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQIDNO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代。


13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述帽类似物具有下式：



其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同；
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。


14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·罗伊，J·翁，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国;US