【技术实现步骤摘要】
一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用。
技术介绍
转座酶是一类具有执行转座能力的蛋白质，可以识别并结合转座子上特异性序列，将转座子通过复制或者剪切的模式随机插入到DNA序列上。由于转座酶的这种特性，许多转座酶被开发和改造为一种分子生物学研究工具，用于二代测序技术中的文库构建。与传统高通量二代测序的文库构建方法：“核酸片段化—末端修复—3’端加A—接头连接”相比较，转座酶只需要一步就可以完成，大大提高文库构建的效率并减少文库构建过程中目标产物的损耗。Tn5转座酶是随机转座子插入形成转座体的关键酶，被广泛用于高通量二代测序文库构建，但由于野生型Tn5蛋白表达量低，酶活性极弱，稳定性差等原因，无法用于二代测序文库构建。目前市场上的Tn5蛋白，仍存在活性不足、不耐储存、结合能力弱等缺点，尚无法同时满足多种类型二代高通量测序文库的构建需求。本专利技术提供了一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用，可极大提高Tn5重组蛋白的表达量、增强Tn5蛋白...
【技术保护点】
1.一种重组突变型Tn5转座酶，其特征在于，所述重组突变型Tn5转座酶构建方法包括：/n以原突变型Tn5转座酶基因为模板，进一步改造突变M56A与E345K两个位点，获得Tn5m核苷酸片段；/n将Tn5m核苷酸片段与EF或TRX1核苷酸片段通过重组反应，获得EF-Tn5m转座酶或TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段；/n所述EF-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述TRX1-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组突变型Tn5转座酶，其特征在于，所述重组突变型Tn5转座酶构建方法包括：
以原突变型Tn5转座酶基因为模板，进一步改造突变M56A与E345K两个位点，获得Tn5m核苷酸片段；
将Tn5m核苷酸片段与EF或TRX1核苷酸片段通过重组反应，获得EF-Tn5m转座酶或TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段；
所述EF-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述TRX1-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
2.根据权利要求1所述的重组突变型Tn5转座酶，其特征在于，步骤（1）所述改造突变M56A与E345K两个位点所需要的引物包括：
56A-F：5′-GGCAGCAAAGCCGCCCAGGAAGGCGCGTAT-3′；
56A-R：5′-ATACGCGCCTTCCTGGGCGGCTTTGCTGCC-3′；
345K-F：5′-CAGCGTATGGAAAAACCGGATAACCTG-3′；
345K-R：5′-CAGGTTATCCGGTTTTTCCATACGCTG-3′。
3.一种包含权利要求1所述重组突变型Tn5转座酶的核苷酸序列的载体，其特征在于，将所述EF-Tn5m转座酶、TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段利用同源重组分别克隆到表达载体pET30a中。
4.一种利用权利要求3所述载体表达制备重组突变型Tn5转座酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将表达载体转入C3013感受态细胞中，放入冰上孵育30min，再热激60s，随后冰上孵育5min；加入200μLLB液体培养基，放入摇床复苏30min后，涂布于终浓度50μg/mL卡那霉素固体培养基上，37℃过夜培养；第二天挑取单菌落进行测序验证；...
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