一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用技术

本发明专利技术提出了一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用，属于生物工程技术领域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术DNA聚合酶来源于嗜热微生物Pyrococcus yayanosii，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。

【技术实现步骤摘要】
一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用。
技术介绍
DNA聚合酶利用dNTP作为底物，以DNA单链作为模板，催化DNA聚合物合成。除了聚合酶活性DNA聚合酶还具有3’-5’外切酶活性和5’-3’外切酶活性，前者在DNA复制中对新合成链进行校对，消除错误掺入的核苷酸，后者参与DNA合成中RNA引物链的去除，完成基因组DNA子链DNA合成，同时5’-3’外切酶活性还参与DNA修复。不同的DNA聚合酶的结构和功能上有所差异。各种DNA聚合酶在生命科学中应用广泛，其中耐热DNA聚合酶多应用于PCR(聚合酶链式反应)技术，尤其是高忠实性的DNA聚合酶在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。其它DNA聚合酶，例如BstDNA聚合酶和phi29DNA聚合酶在等温核酸扩增和二代测序中应用广泛。Pyrococcusyayanosii分离自海底热液口，是一株严格厌氧嗜压超嗜热古菌。该古菌的温度生长范围是80～114℃，最佳生长温度为99℃，是研究开发具有热稳定的极端耐热酶的重要菌株资源。目前商业化的DNA聚合酶仍然存在忠实性低，延伸效率差，污染物或抑制剂耐受能力差等问题。因此，有必要开发一种高忠实性的DNA聚合酶体系，用于PCR扩增目的DNA。CN108795900B公开了一种DNA聚合酶及其制备方法，为如下A1)-A3)中的任一种：A1)对9°NDNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°NDNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°NDNA聚合酶相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低，该DNA聚合酶制备方法复杂且不具有高忠实性。CN112029744A公开了一种DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用，源于嗜热微生物Thermococcuseurythermalis，具有热稳定性高、扩增能力强，DNA扩增产量高，扩增忠实性高等特征，可应用于PCR扩增目的DNA。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。但该DNA聚合酶纯化较难，制备工艺复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供一种高忠实性DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术进一步保护一种编码上述高忠实性DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列表如SEQIDNO.2所示。本专利技术进一步保护含上述高忠实性DNA聚合酶的重组表达菌。作为本专利技术的进一步改进，所述重组表达菌为大肠杆菌。本专利技术进一步保护一种上述高忠实性DNA聚合酶的基因的制备方法，包括以下步骤：(2)对权利要求3所述重组表达菌进行扩大培养、诱导表达；(2)收集诱导培养后的菌体，进行细胞破碎、离心，得到细胞裂解液上清；(3)对上清液进行镍离子亲和纯化和离子交换纯化，得到所述DNA聚合酶。本专利技术进一步保护一种上述高忠实性DNA聚合酶在PCR中的应用。作为本专利技术的进一步改进，所述PCR应用中包含PCR反应缓冲液。作为本专利技术的进一步改进，所述PCR反应缓冲液含20mMTris-HCl或Tricine-NaOH(pH8.2)，3mMMgCl2，40mMKCl，4mM(NH4)2SO4，0.01％TritonX-100和0.005％BSA。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术DNA聚合酶来源于嗜热微生物Pyrococcusyayanosii，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶的纯化结果图；图2为Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的pH优化图；图3为Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的氯化镁浓度优化图；图4为Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的氯化钾浓度优化图；图5为Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的硫酸铵优化图；图6为Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的TritonX-100浓度优化图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶的制备与PCR应用1、重组表达载体的构建基于Pyrococcusyayanosii的基因组序列获得B型DNA聚合酶基因原始序列，在原始序列基础上，去除Intein序列，获得成熟的基因序列，并对重要残基进行突变，提高聚合酶活性。最后通过基因合成法获得修改后的B型DNA聚合酶基因，，并优化密码子，得到去除了intein序列的适合于再大肠杆菌中表达的Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶成熟基因，如SEQIDNO.2所示。使用BamHI和NdeⅠ双酶切pET-28a载体，并用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。使用BamHI和NdeⅠ双酶切PCR扩增的Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶成熟基因片段，PCR回收试剂盒回收，利用T4DNA连接酶将NdeI与BamHI酶切的pET28a质粒与Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶成熟基因连接在一起，构建成功Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶的重组表达载体，将其转化到DH5α感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性筛选为阳性的菌落，进行菌液PCR验证，验证阳性的重组克隆进行DNA序列测定，验证Pyrococcusyaya本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高忠实性DNA聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种高忠实性DNA聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种编码权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列表如SEQIDNO.2所示。


3.含权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶的重组表达菌。


4.根据权利要求3所述的重组表达菌，其特征在于，所述重组表达菌为大肠杆菌。


5.一种如权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶的基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对权利要求3所述重组表达菌进行扩大培养、诱导表达；
(2)收集诱导培...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，翁妍，王风平，
申请(专利权)人：上海交通大学，中国大洋矿产资源研究开发协会中国大洋事务管理局，
类型：发明
国别省市：上海;31