2,4-二羟基丁酸的生产方法技术

本发明专利技术涉及通过合成途径生产2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)的方法，包括使用苹果酸激酶将苹果酸转化为4-磷酸-苹果酸，使用苹果酸半醛脱氢酶将所述4-磷酸苹果酸转化为苹果酸-4-半醛，并使用DHB脱氢酶将所述苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过使用合成途径从苹果酸生产2,4-二羟基丁酸的新方法，合成途径包含分别具有苹果酸激酶，苹果酸半醛脱氢酶，和2,4-二羟基丁酸脱氢酶活性的酶。本申请中引用的羧酸在其盐(如2,4-二羟基丁酸盐)或酸(如2,4-二羟基丁酸)形式下是等同命名的。2,4-二羟基丁酸(等同2,4-DHB或DHB)是有相当经济效益的化合物。通过调整适合的pH，可以在水介质中容易地将DHB转化为α-羟基-γ-丁内酯。α-羟基-γ-丁内酯是生产在动物营养中有很大市场的甲硫氨酸物2-羟基-4-(甲硫基)-丁酸(HMTB)的重要前体(Decketal.,2008)。目前，α-羟基-γ-丁内酯通过包含γ-丁内酯在α位置的卤化，并随后在碱性介质中以羟基替代卤素原子的多阶段反应衍生自γ-丁内酯(Decketal.,2008)。由于油价的增长，从可再生资源生产DHB的需要升高。微生物能够将源自生物质的原料，如糖或有机酸，转化为大量各种不同的化学化合物(Werpy&Petersen，2004)。随着生物化学和基因组学信息量的增长，可以修饰微生物以使其能以高产量和产率过量生产天然发生的代谢中间体(Bailey,1991)。生产微生物的优化经常需要合理的代谢网络工程，这确保其中目标代谢物的生物合成所需的酶过量表达，并减轻产物的反馈抑制。另外的可能性是使用能催化目标代谢物生产的新酶系统。代谢工程方法和酶催化需要生化和产生目标代谢物的代谢途径调节方面的详细知识。在生产DHB的情况下，这些信息是无法获得的。仅有少量研究报道了琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症患者中的DHB发生(Shinkaetal.2002)，然而没有确定DHB生产中涉及的酶反应。因此，DHB的发酵或酶生产需要(i)确定能将易得到的前体转化为DHB的热力学可行途径，(ii)确定或构建途径中能够催化各反应步骤的酶和(iii)在适合的生物生产中，途径酶的功能表达。本专利技术目的是为满足这些需求。因此，本专利技术的一个目的是生产2,4-DHB的方法，包括使用苹果酸激酶将苹果酸转化为4-磷酸-苹果酸的第一步骤，使用苹果酸半醛脱氢酶将4-磷酸-苹果酸转化为苹果酸-4-半醛的第二步骤，使用DHB脱氢酶将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB的第三步骤。在第一个反应中(见图1(i))，通过具有苹果酸激酶活性的酶的作用，苹果酸(1)被转化为4-磷酸-苹果酸(2)(A)。在第二个反应(B)中，通过具有苹果半醛脱氢酶活性的酶的作用，4-磷酸-苹果酸被转化为苹果酸-4-半醛(3)。更准确地，反应(B)是由在生物合成途径意义中具有脱磷酸4-磷酸-苹果酸还原酶活性的酶来催化。在第三反应(C)中，通过具有DHB脱氢酶活性的酶的作用，苹果酸-4-半醛被转化为DHB。更准确地，反应(C)是由在生物合成途径意义中具有苹果酸-4-半醛还原酶活性的酶来催化。目前为止在活细胞中既没有描述过也没有确认过上面引用的酶和中间产物。这样苹果酸激酶，苹果酸半醛脱氢酶，DHB脱氢酶和4-磷酸-苹果酸是本专利技术进一步的目的。在本专利技术另外一个方面中，生产2,4-DHB方法的第一步骤包括苹果酸激酶，其特征在于其能将苹果酸转化为4-磷酸-苹果酸。所述酶可以通过酶的至少一个突变获得，所述突变改进了突变酶对苹果酸的活性和/或底物亲和力。在本专利技术中，表述“改进活性和/或底物亲和力”意思是突变前的酶，要么是-不能使用底物(苹果酸，4-磷酸-苹果酸或苹果酸-4-半醛)，和/或-以低于最大特定速率的至少3倍的速率(atamaximumspecificrateatleastthreetimeslower)来合成反应产物(4-磷酸-苹果酸或苹果酸-4-半醛或DHB)，和/或-对苹果酸，4-磷酸-苹果酸，或苹果酸-4-半醛具有低于至少3倍(atleastthreetimeslower)的亲和力，和/或-对天然底物(天冬氨酸，4-磷酸-天冬氨酸，天冬氨酸-4-半醛)具有高于至少3倍(atleast3timeshigher)的亲和力。在其另外一个方面，本专利技术涉及苹果酸激酶将苹果酸转化为4-磷酸-苹果酸的用途。苹果酸激酶的活性可以通过实施例1中描述的酶测试来测量(见“酶测定”)。根据本专利技术另外一个方面，苹果酸激酶可以通过突变天冬氨酸激酶获得。图2显示了不同生物来源天冬氨酸激酶的氨基酸序列比对。所有氨基酸位置的参照是基于大肠杆菌LysC基因编码的天冬氨酸激酶氨基酸序列(SEQIDNo.4所示)来制作。通过与下列酶如图2中所示的简单序列比对，本领域技术人员可以容易地发现来自不同生物的其他天冬氨酸激酶中对应保守区域的相对位置：-AKIII-大肠杆菌天冬氨酸激酶III(SEQIDNo.4)，-AKI(SEQIDNo.87)大肠杆菌天冬氨酸激酶I，-AKII(SEQIDNo.88)-大肠杆菌天冬氨酸激酶II，-MJ-詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)(SEQIDNo.89)，-TT-嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(SEQIDNo.90)，-CG-谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)(SEQIDNo.91)，-AT-拟南芥(Arabidopsisthaliana)(SEQIDNo.92)，-SC-酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(SEQIDNo.93)。所述比对可以以ClustalW2软件完成。例如，SEQIDNo.4所示天冬氨酸激酶的E119残基对应拟南芥天冬氨酸激酶的E207残基(SEQIDNo.50)或对应于酿酒酵母天冬氨酸激酶的E147残基(SEQIDNo.51)。与野生型酶相比，根据本专利技术的突变天冬氨酸激酶包括至少一个在至少一个下列位置的突变：S39，T45，V115，E119，F184和/或S201，其中所述位置天然发生的氨基酸被其他19个天然存在的蛋白氨基酸的任一个取代，即被丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或缬氨酸任一所取代。在非排他的例子中，使用大肠杆菌天冬氨酸激酶LysC作为模板验证了通过定点突变构建苹果酸激酶。根据本专利技术的一个方面，通过以天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸或甘氨酸任一来替代119位上的谷氨酸，LysC的底物特异性向苹果酸改变。在本专利技术进一步的方面中，苹果酸激酶由SEQIDNo.9，更具体的由S本文档来自技高网...

【技术保护点】
苹果酸半醛脱氢酶，其特征在于其能将4‑磷酸‑苹果酸转化为苹果酸‑4‑半醛。

【技术特征摘要】
2010.10.28 WO PCT/IB2010/003153;2011.05.23 WO PCT/1.苹果酸半醛脱氢酶，其特征在于其能将4-磷酸-苹果酸转化为苹果酸-4-半醛。
2.根据权利要求1的苹果酸半醛脱氢酶，其通过酶的至少一个突变获得，所述突变改进
了突变酶对4-磷酸-苹果酸的活性和/或底物亲和力。
3.根据权利要求1或2的苹果酸半醛脱氢酶，其中所述酶是天冬氨酸半醛脱氢酶。
4.根据权利要求3的苹果酸半醛脱氢酶，其中与野生型酶相比，突变的天冬氨酸半醛脱
氢酶包括至少一个在下列位置之一的突变：T136，Q162，I230，E241和/或H274，其中所述位
置天然发生的氨基酸被其他19个天然存在的蛋白氨基酸的任一个取代，即被丙氨酸，精氨
酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，
赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或缬氨酸任一所取
代。
5.根据权利要求3的苹果酸半醛脱氢酶，其由SEQIDNo.68，SEQIDNo.54，SEQID
No.56，SEQIDNo.58，SEQIDNo.60，SEQIDNo.62，SEQIDNo.64，SEQIDNo.66或SEQ
IDNo.231所示。
6.分离的核酸序列，其编码根据权利要求1到5任一项的苹果酸半醛脱氢酶。
7.权利要求6的分离的核酸，其由SEQIDNo.55，SEQIDNo.57，SEQIDNo.59，SEQID
No.61，SEQIDNo.63，SEQIDNo.65，SEQIDNo.67，或SEQIDNo.230所示。
8.嵌合基因，包括至少在转录方向功能连接的，在宿主生物中有功能的启动子调控序
列，至少一个根据权利要求1到5任一项的...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·瓦尔特，伊莲娜·科迪尔，克里斯多夫·陶汉姆，伊莎贝尔·安德烈，马加利·芮茂德西蒙，罗伯特·胡艾特，让玛丽·弗朗索瓦，
申请(专利权)人：安迪苏法国联合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR