一种羰基还原酶突变体及其基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种羰基还原酶突变体及其基因，包含该羰基还原酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该重组酶在不对称还原4‑氯‑3‑羰基丁酸乙酯及其他潜手性羰基化合物以制备光学纯(S)‑4‑氯‑3‑羟基‑丁酸乙酯及其他手性仲醇中的应用。与野生型羰基还原酶相比，本发明专利技术所述羰基还原酶突变体对4‑氯‑3‑羰基丁酸乙酯的还原活力有大幅提高，且部分突变体的热稳定性也有明显提高，使用该突变体能够更好地催化制备光学纯(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，具有很好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体及其基因与应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种天蓝色链霉菌羰基还原酶ScCR1突变体及其编码基因，含有所述羰基还原酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组羰基还原酶及其制备方法，以及该羰基还原酶突变体在催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不对称还原，制备光学纯(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的应用。
技术介绍
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[Ethyl(S)-(-)-4-chloro-3-hydroxybutyrate,(S)-CHBE]，分子式：C6H11ClO3，分子量：166.60，CAS号为86728-85-0。光学纯(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶(HMG-CoA)还原酶抑制剂的重要医药中间体。从药理作用分析看来，该HMG-CoA还原酶抑制剂是药物阿托伐他汀的主要活性成分。阿托伐他汀，商品名“立普妥”，是他汀类血脂调节药物，该药物主要作用于肝脏，口服后，产生的水解物能够竞争性抑制HMG-CoA还原酶，促进低密度脂蛋白受体的合成，由于HMG-CoA还原酶是胆固醇合成所需要的关键酶，所以会导致胆固醇的合成无法正常进行，最终不仅降低了总胆固醇水平，还降低了血清甘油三酯水平，因此能够有效防治动脉粥样硬化和冠心病。目前阿托伐他汀是降胆固醇类药物的首选。化学催化手性仲醇合成的方法主要是利用过渡态金属或硼烷作为催化剂，与手性配体形成配合物后高效催化硼氢化物等氢供体向潜手性羰基基团的不对称转移，生成光学活性的手性仲醇。然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因而化学法合成应用受到限制。目前，研究人员已开发多种生物法合成光学活性手性仲醇的方法，包括酶法动力学拆分和酶促不对称还原法。其中，利用潜手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性仲醇的途径，可实现理论100％的产率，是生产光学活性(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重要方法。生物不对称还原方法具有绿色高效、选择性高、反应条件温和以及操作简单易于制备等诸多优点，因此近几年来生物催化羰基不对称还原合成手性仲醇的方法越来越受到重视。采用酶法不对称还原法制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，一般采用的是羰基还原酶，催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯(简写为COBE)的不对称还原。Kita等人用赭色掷孢酵母来源的羰基还原酶AR不对称还原COBE合成(S)-CHBE，产物的对映体过量值(ee)为93％(J.Mol.Catal.B.Enzym.,1999,6:305-313)，Kataoka等用马其顿假丝酵母来源的羰基还原酶CmMR不对称合成(S)-CHBE，其产物的对映体过量值(ee)仅为92％(EnzymeMicrob.Technol.,2006,38:944-951)。Ye等人通过对毕赤酵母中基因数据库挖掘，筛选得到了两种新型羰基还原酶PsCRI和PsCRII，其催化还原COBE后产物的对映体过量值(ee)均>99％(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,89:513-522)。何等人用来源于重组大肠杆菌CCZU-Y10的PgCR在邻苯二甲酸二丁酯-水两相体系中催化COBE不对称还原制备(S)-CHBE，底物浓度为1000mM,产物的ee值高于99％，转化率高达99％(Appl.Biochem.Biotechnol.,2014,173:2042-2053)。从天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中克隆得到的羰基还原酶ScCR1能够催化多种高浓度羰基化合物的高立体选择性不对称还原，制备相应的光学手性醇，该酶已经在大肠杆菌(Escherichiacoli)中重组过量表达(BioresourTechnol.2011,102:7023-7028)。但该酶对4-氯-3-羰基丁酸乙酯的活力中等，纯酶的比活力仅有16U/mg，且该羰基还原酶的热稳定性也不够好，(保温15min后残余活力仅有一半时对应的温度)也只有47.4℃，表征对底物耐受性的(保温15min后残余活力仅有一半时对应的底物浓度)也仅为34mM。通过定点突变、随机突变等蛋白质工程的手段对ScCR1进行催化性能(催化活力、稳定性)的改造，提高其催化活力及其反应稳定性，将具有较高的工业应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：羰基还原酶ScCR1催化还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯活力低及反应稳定性差的问题。针对该问题，提供一种催化性能提高的羰基还原酶突变体蛋白质、编码该突变体蛋白质的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，该羰基还原酶突变体的制备方法及其在催化羰基不对称还原，制备光学纯手性醇中的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术采取的技术方案之一是：提供一种对4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活性提高，稳定性提高的羰基还原酶ScCR1突变体蛋白质。对具有如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质进行突变，将第158位的异亮氨酸替换为缬氨酸，或者在此基础上，对第168位的脯氨酸、第60位的丙氨酸分别或同时进行氨基酸残基的替换，获得由ScCR1衍生的且羰基还原酶活性提高的突变体蛋白质。突变体ScCR1I158V所示的氨基酸序列组成的蛋白质是从由ScCR1构建的定点饱和突变库中筛选得到。在筛选获得对4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活力有明显提高的突变体ScCR1I158V的基础上，继续对ScCR1I158V进行改造，主要采取随机突变的手段以进一步强化该酶的催化活力并提高它的稳定性。优选的，所述羰基还原酶突变体，为野生羰基还原酶ScCR1的氨基酸残基发生如下任意一种情况的突变所获得的突变体；(1)野生型羰基还原酶ScCR1的氨基酸序列中第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，命名为ScCR1I158V；(2)野生型羰基还原酶ScCR1的氨基酸序列中第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，且第168位脯氨酸替换为丝氨酸，命名为ScCR1I158V/P168S；(3)野生型羰基还原酶ScCR1的氨基酸序列中第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，且第168位脯氨酸替换为丝氨酸，且第60位丙氨酸替换为苏氨酸，命名为ScCR1A60T/I158V/P168S。所述突变体的获得方法具体为：以来源于天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中的羰基还原酶野生酶ScCR1基因为模板，利用含有突变点的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸位点上下游各15～20bp的一段碱基序列，将突变位点的碱基替换为突变后氨基酸的密码子，作为PCR正向引物，其反向互补序列即为PCR反向引物)构建定点饱和突变库，对所得到的突变基因库进行高通量筛选，得到对4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活力提高的突变体ScCR1I158V(kcat/KM为89s-1mM-1)；以突变体ScCR1I158V基因为模板，利用随机突变引物进行易错PCR构建随机突变库，对所得到的突变基因库进行高通量筛选，得到活力提高的且稳定性提高的突变体ScCR1I158V/P168S(kcat/KM为196s-1mM-1,为49.2℃,为122mM)；以突变体ScCR1I158V/P168S基因为模板，利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羰基还原酶突变体，其特征在于，其是如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第60位丙氨酸、158位异亮氨酸或168位脯氨酸残基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的活性提高的羰基还原酶突变体。

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，其是如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第60位丙氨酸、158位异亮氨酸或168位脯氨酸残基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的活性提高的羰基还原酶突变体。2.根据权利要求1所述的一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体有如下序列：(1)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第158位异亮氨酸替换为缬氨酸；(2)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，第168位脯氨酸替换为丝氨酸；(3)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第60位丙氨酸替换为苏氨酸，第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，第168位脯氨酸替换为丝氨酸。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志钧，郁惠蕾，李敏，许建和，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31