羰基还原酶生物催化生产立体互补的N‑杂环醇类化合物制造技术

本发明专利技术公开了一种利用羰基还原酶生物催化N‑杂环酮类化合物制备立体互补的手性N‑杂环醇类化合物的方法，以羰基还原酶RE‑ADH为催化剂，得到(S)构型的产物；以羰基还原酶ChKRED20为催化剂，得到(R)构型的产物。与现有技术相比，本发明专利技术所采用的方法具有催化剂易制备、反应条件温和、反应体系简单、无副反应、得到的产物光学纯度高的优点，具有极大地工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶与生物催化领域，具体涉及利用羰基还原酶生物催化生产立体互补的手性N-杂环醇类化合物的方法。
技术介绍
N-杂环醇类衍生物，尤其是手性N-杂环醇类衍生物是一类在医药领域具有重要研究价值的化合物，作为药物合成的重要中间体，被广泛的应用于镇痛、抗精神病、抗肿瘤、抗心血管病等药物的合成。目前，制备手性N-杂环醇类衍生物的方法主要有通过手性源环化合成法、化学拆分法和生物转化法。手性源环化合成法，如下所示：主要以天然的手性化合物为起始原料，经过多步的环化反应得到手性纯的3-羟基哌啶衍生物。该方法存在反应步骤繁琐，终产物的收率低，产物的光学纯度较低、生产成本较高的缺点。化学拆分法，如下所示：主要是将外消旋的3-羟基哌啶在手性酸的作用下成盐析出得到手性的盐，然后游离上保护基得到手性的N-取代-3羟基哌啶，该方法存在拆分收率低、操作繁琐、生产成本较高、原子经济性低的缺点。生物转化法，如下所示：利用磨碎的野生胡萝卜的根为生物催化剂，将不同取代的N-杂环酮类化合物还原得到(S)-N-杂环醇类化合物，该方法存在催化剂的需求量大、产物的光学纯度不够高的问题，反应效率低，生产成本高，很难被应用于工业化生产中。
技术实现思路
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本专利技术旨在提供一种以羰基还原酶为生物催化剂制备立体互补的手性N-杂环醇类化合物的方法，以满足工业化生产要求。具体地，本专利技术所用的底物为如下结构通式(I)，利用不同的高效高选择性羰基还原酶为生物催化剂，经不对称还原获得相应(S)或(R)构型手性醇。生物催化过程可表示如下：其中，n在每次出现时独立地为1、2或3；m在每次出现时独立地为1或2；R在每次出现时独立地选自叔丁氧羰基，苄基，苄氧羰基，或乙基氧羰基等；进一步说，反应是将N-杂环酮类化合物用(R)-羰基还原酶还原为(R)-N-杂环醇类化合物，或用(S)-羰基还原酶还原为(S)-N-杂环醇类化合物。进一步说，所述的(R)-羰基还原酶为ChKRED20；(S)-羰基还原酶还原为RE-ADH；所述的羰基还原酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。进一步说，所述的羰基还原酶推荐以酶粉形式或含有羰基还原酶的细胞破碎液的形式加入。根据本领域的公共知识，本领域技术人员可通过以下方式获得生物催化剂。首先，羰基还原酶的信息(基因序列和氨基酸序列)可通过该酶的NCBI登录号查询获知，然后经基因合成公司合成获得，并以常规技术手段构建大肠杆菌表达体系，经过量表达获得上述酶作为生物催化剂。RE-ADH在NCBI数据库的登录号为：AY161280；ChKRED20在NCBI数据库的登录号为：KC342020。本专利技术的生物催化体系及反应条件：(1)生物催化剂为羰基还原酶RE-ADH纯酶或者粗酶时，生物催化体系为：磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6～7)、羰基还原酶、结构通式(I)底物和还原型辅酶NADH；或者，生物催化体系为：磷酸盐缓冲(0.1M，pH6～7)、羰基还原酶、结构通式(I)底物、氧化型辅酶NAD+，异丙醇。上述反应体系中，羰基还原酶的酶量可根据底物浓度调整，较优的浓度为纯酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以总蛋白量计)。优选的，底物终浓度为1～120g/l；NAD+浓度0.1～1g/l；异丙醇的浓度为5％(v/v)；NADH的摩尔浓度大于等于底物的摩尔浓度。生物催化条件：温度20～50℃，转速50～220rpm，转化时间为1～24h。(2)生物催化剂为羰基还原酶ChKRED20纯酶或者粗酶时，生物催化体系为：磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物和还原型辅酶NADH；或者，生物催化体系为：磷酸盐缓冲(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物、氧化型辅酶NAD+，异丙醇。上述反应体系中，羰基还原酶的酶量可根据底物浓度调整，较优的浓度为纯酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以总蛋白量计)。优选的，底物终浓度为1～40g/l；NAD+浓度0.1～1g/l；异丙醇的浓度为20～50％(v/v)；NADH的摩尔浓度大于等于底物的摩尔浓度。生物催化条件：温度20～40℃，转速50～220rpm，转化时间为1～24h。本专利技术的有益效果：本专利技术公开了以羰基还原酶生物催化方法获得立体互补手性N-杂环醇类化合物，该方法的催化剂易制备，水相催化，反应条件温和，反应体系简单，无副反应，ee值绝大多数大于99％，为手性N-杂环醇类化合物生产提供了可选择的环境友好的生物催化方法，具有极大地工业应用价值。本专利技术所获得的手性N-杂环醇类化合物可作为很多药物合成中的中间体。以生产5b产物为例(见实施例1和实施例27)，RE-ADH催化底物5a时，底物浓度为120g/l时,转化率为97.4％，ee值>99％，具有很强的工业应用潜力。附图说明图1为本专利技术涉及的生物催化过程示意图。其中，n在每次出现时独立地为1、2或3；m在每次出现时独立地为1或2；R在每次出现时独立地选自叔丁氧羰基，苄基，苄氧羰基，或乙基氧羰基等；ChKRED20为催化剂时，得到(R)-构型醇；RE-ADH为催化剂时，得到(S)-构型醇。具体实施方式以下结合实施例详细地说明本专利技术。实施方案为便于更好的理解本专利技术，但并非对本专利技术的限制。实施例1：羰基还原酶的筛选以本领域熟知的方法，将羰基还原酶基因连入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，6,000rpm，4℃离心10min获得重组菌湿菌体,重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液，作为生物催化剂。筛选时，生物催化及体系为：磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)、羰基还原酶粗酶液10g/l、底物1g/l、NAD+浓度0.6g/l和异丙醇5％(v/v)。反应时间为24h，反应温度30℃，转速200rpm。同时，将没有连入羰基还原酶基因的pET28(+)空载体同样转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清为空白对照转化各类底物。以下展示的筛选结果，空白对照均不能转化底物。反应结束后，以等体积甲基叔丁基醚萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，而后减压旋蒸除去溶剂，加入异丙醇(HPLC级)溶解样品，高速离心后HPLC测定样品的转化率及产物ee值。(1)羰基还原酶催化还原的底物及HPLC检测条件，见表1：表1底物及测定条件(2)羰基还原酶催化各底物的反应转化率和产物ee值，见表2。其中，RE-ADH催化后得到(S)构型产物；ChKRED20催化后得到(R)构型产物。以下实施例的相应产物构型均相同，不再赘述。表2两个酶对不同底物的转化率和ee值实施例2：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物1a取新鲜培养的羰基还原酶RE-ADH重组菌湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，羰基还原酶RE-ADH浓度10g/l(粗酶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羰基还原酶生物催化生产立体互补的N‑杂环醇类化合物的方法，其特征为：以式(I)所示的N‑杂环酮类化合物为底物，以羰基还原酶ChKRED20或者RE‑ADH为生物催化剂，经生物催化获得手性醇。生物催化过程可表示如下：其中，n在每次出现时独立地为1、2或3；m在每次出现时独立地为1或2；R在每次出现时独立地选自叔丁氧羰基，苄基，苄氧羰基，或乙基氧羰基等。

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶生物催化生产立体互补的N-杂环醇类化合物的方法，其特征为：以式(I)所示的N-杂环酮类化合物为底物，以羰基还原酶ChKRED20或者RE-ADH为生物催化剂，经生物催化获得手性醇。生物催化过程可表示如下：其中，n在每次出现时独立地为1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴中柳，李超，刘艳，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51