用于甘薯亲子鉴定的引物体系及其筛选方法与试剂盒技术

本发明专利技术公开用于甘薯亲子鉴定的引物体系及其筛选方法与试剂盒，具体地，其筛选方法包括以下步骤：1)SSR分子标记设计；2)DNA提取；3)PCR扩增和4)电泳分离，最终选择多态性高、重复稳定性和遗传稳定性好、扩增条带清晰的引物对组成甘薯亲子鉴定引物体系。通过本方法筛选出的引物体系位点具有共显性、多态性高、重复性好、条带清晰、且遗传稳定性高等特点，利用甘薯微卫星分子标记的多态性引物进行甘薯的亲子关系鉴定，在甘薯亲缘关系的审定和辨别、亲缘关系的保护、产权纠纷等领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于甘薯亲子鉴定的引物体系及其筛选方法与试剂盒,属于植物物种鉴定

技术介绍
1949年以来，我国甘薯科技事业获得飞速发展，但在甘薯育种中，由于长期对产量和抗性等少数性状的人工选择以及仅用少数亲本进行品种选育，造成育种背景单一、遗传基础日益狭窄、遗传多样性下降。因此有必要对甘薯的种质资源进行遗传多样性的研究，以充分挖掘有价值的材料，为甘薯遗传育种服务。亲子鉴定(Parentageidentification)是指应用医学、遗传学和生物学等理论、技术来检测分析父母与子女之间的遗传关联,判断他们是否存在亲生关系。在法医学上有广泛的应用。DNA分子标记技术,可直接揭示DNA分子水平上的差异,无器官、组织及发育阶段的特异性,是一种实验室区别和鉴定品种的有效方法。SSR即简单序列重复，也叫微卫星序列重复，是一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。与其他分子标记方法相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)技术重复性好，易于操作，结果可靠。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种应用SSR技术的用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法，包括以下步骤：1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；扩增产物大小100-400bp；引物长度18-24bp，扩增率大于80％；2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，稀释，保存备用；3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；4)电泳分离：扩增产物用凝胶电泳检测，用AgNO3溶液染色5min，漂洗，显影，选择多态性高、重复稳定性和遗传稳定性好、扩增条带清晰的引物对，得到引物体系。作为优选，步骤3)中，PCR扩增体系为10μL，包括如下组分：0.15μLTaqDNA聚合酶、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、0.8μLdNTPs、1.0μL基因组DNA、1.0μL10×PCRBuffer、补足至10μL的ddH2O。作为优选，步骤3)中，TaqDNA聚合酶的浓度为2.5U/μL、上游引物的浓度为20pmol/μL、下游引物的浓度为20pmol/μL、dNTPs的浓度为2.5mmol/L、基因组DNA的浓度为20ng/μL。作为优选，步骤3)中，PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃-60℃退火温度30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃下延伸7min，4℃保存。作为优选，步骤4)后还包括步骤5)检测遗传稳定性：检测步骤4)获得的引物对在亲代与子代间是否符合孟德尔遗传规律。作为优选，步骤4)中，使用由3w.t.％NaOH和0.4w.t.％甲醛组成显影液显影。本专利技术的另一目的在于提供上述方法获得的引物体系。作为优选，所述引物体系包括以下引物对：GDAAS0338上游引物如SEQIDNo.1所示；GDAAS0338下游引物如SEQIDNo.2所示；GDAAS0354上游引物如SEQIDNo.3所示；GDAAS0354下游引物如SEQIDNo.4所示；GDAAS0360上游引物如SEQIDNo.5所示；GDAAS0360下游引物如SEQIDNo.6所示；GDAAS0782上游引物如SEQIDNo.7所示；GDAAS0782下游引物如SEQIDNo.8所示；GDAAS0819上游引物如SEQIDNo.9所示；GDAAS0819下游引物如SEQIDNo.10所示；GDAAS0843上游引物如SEQIDNo.11所示；GDAAS0843下游引物如SEQIDNo.12所示；GDAAS0848上游引物如SEQIDNo.13所示；GDAAS0848下游引物如SEQIDNo.14所示；GDAAS0858上游引物如SEQIDNo.15所示；GDAAS0858下游引物如SEQIDNo.16所示；GDAAS0871上游引物如SEQIDNo.17所示；GDAAS0871下游引物如SEQIDNo.18所示；GDAAS0911上游引物如SEQIDNo.19所示；GDAAS0911下游引物如SEQIDNo.20所示；GDAAS0914上游引物如SEQIDNo.21所示；GDAAS0914下游引物如SEQIDNo.22所示；GDAAS0922上游引物如SEQIDNo.23所示；GDAAS0922下游引物如SEQIDNo.24所示；GDAAS0926上游引物如SEQIDNo.25所示；GDAAS0926下游引物如SEQIDNo.26所示；GDAAS0940上游引物如SEQIDNo.27所示；GDAAS0940下游引物如SEQIDNo.28所示。本专利技术的目的之三在于提供用于甘薯亲子鉴定的试剂盒，包括上述的引物体系。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用甘薯微卫星分子标记的多态性引物进行甘薯的亲子关系鉴定，所筛选出来的引物体系位点具有共显性、多态性高、重复性好、条带清晰、且遗传稳定性高等特点，能够准确客观的鉴定出甘薯的亲子关系，在甘薯亲缘关系的审定和辨别、亲缘关系的保护、产权纠纷等领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为GDAAS0338的亲子鉴定扩增图谱；图2为GDAAS0354的亲子鉴定扩增图谱；图3为GDAAS0360的亲子鉴定扩增图谱；图4为GDAAS0782的亲子鉴定扩增图谱；图5为GDAAS0819的亲子鉴定扩增图谱；图6为GDAAS0843的亲子鉴定扩增图谱；图7为GDAAS0848的亲子鉴定扩增图谱；图8为GDAAS0858的亲子鉴定扩增图谱；图9为GDAAS0871的亲子鉴定扩增图谱；图10为GDAAS0911的亲子鉴定扩增图谱；图11为GDAAS0914的亲子鉴定扩增图谱；图12为GDAAS0922的亲子鉴定扩增图谱；图13为GDAAS0926的亲子鉴定扩增图谱；图14为GDAAS0940的亲子鉴定扩增图谱。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：本专利技术通过以下步骤筛选用于甘薯亲子鉴定的引物体系：1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；扩增产物大小100-400bp；引物长度18-24bp，扩增率大于80％；2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，稀释，保存备用；3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；4)电泳分离：扩增产物用凝胶电泳检测，用AgNO3溶液染色5min，双蒸水漂洗2次，显影，选择多态性高、重复稳定性好、扩增条带清晰的引物对，得到引物体系。实施例1：1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域采用PrimerPremier软件设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法，包括以下步骤：1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50‑60℃；扩增产物大小100‑400bp；引物长度18‑24bp，扩增率大于80％；2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，稀释，保存备用；3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；4)电泳分离：扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用AgNO3溶液染色，漂洗，显影，选择多态性高、重复稳定性和遗传稳定性好、扩增条带清晰的引物对，即得到引物体系。

【技术特征摘要】
1.用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法，包括以下步骤：1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；扩增产物大小100-400bp；引物长度18-24bp，扩增率大于80％；2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，稀释，保存备用；3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；4)电泳分离：扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用AgNO3溶液染色，漂洗，显影，选择多态性高、重复稳定性和遗传稳定性好、扩增条带清晰的引物对，即得到引物体系。2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，PCR扩增体系为10μL，包括如下组分：0.15μLTaqDNA聚合酶、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、0.8μLdNTPs、1.0μL基因组DNA、1.0μL10×PCRBuffer、补足至10μL的ddH2O。3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，TaqDNA聚合酶的浓度为2.5U/μL、上游引物的浓度为20pmol/μL、下游引物的浓度为20pmol/μL、dNTPs的浓度为2.5mmol/L、基因组DNA的浓度为20ng/μL。4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃-60℃退火温度30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃下延伸7min，4℃保存。5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)中，使用由3w.t.％NaOH和0.4w.t.％甲醛组成的显影液显影。6.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)后还包括步骤5)检测遗传稳定性：检测步骤4)获得的引物对在亲代与子代间是否符合孟德尔遗传规律。7.如权利要求1-6任一项获得的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗忠霞，房伯平，王章英，黄立飞，陈新亮，陈景益，张雄坚，姚祝芳，
申请(专利权)人：广东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44