基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组、其获取方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组、其获取方法及应用，本发明专利技术基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。本发明专利技术首次公开了川芎EST‑SSR标记引物组，该引物经验证后得到多态性较高的74对EST‑SSR，与通用引物相比，川芎EST‑SSR标记引物组具有多态性高，易扩增，重复性好，结果更准确等优点，可用于后续川芎的遗传图谱构建、川芎品种指纹图谱构建等基础研究，促进川芎分子育种和功能基因发掘、中药品种标准化等应用研究。

EST SSR primer group, Chuanxiong transcriptome development and application of the acquisition method based on

The invention discloses a EST SSR primer group, Chuanxiong transcriptome development and application of the acquisition method based on the EST SSR primer group Chuanxiong transcriptome development include 74 pairs of primers based on the nucleotide sequence of the primers such as SEQ ID NO:1 order list to SEQ ID shown in NO:148. The invention discloses first Chuanxiong EST SSR primer group, the primers after verification of EST SSR 74 high polymorphism, compared with universal primers, EST Chuanxiong SSR primer group with high polymorphism, easy amplification, good repeatability, the advantages of more accurate results, on the basis of construction, genetic in the follow-up of Ligusticum chuanxiong of available varieties of fingerprint construction, promote the application of Chuanxiong molecular breeding and discovering functional genes, such as the standard of traditional Chinese medicines.

【技术实现步骤摘要】
基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用
本专利技术属于分子标记技术开发及应用的
，更具体地，涉及一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。
技术介绍
川芎为是伞形科藁本属药用植物，主要种植于四川彭州，都江堰等地，是我国著名传统中药材，以其干燥根茎入药，其味辛，性温，有活血行气、祛风止痛功效，用于治疗头痛、风湿、月经不调等。川芎有效成分研究十分深入，研究者分离出了包括川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等多种有效成分。检索川芎研究文献结果显示，对川芎活性成分提取，药理药性上的研究较多。对川芎遗传多样性、种质指纹图谱、基因定位、遗传图谱构建、分子育种等研究却鲜有报道，川芎中能够用于上述研究的分子标记甚少，都是一些通用引物，如RAPD、ISSR、ITS等，使得川芎分子研究难以深入，严重限制了川芎优质种质资源快速、有效的选育及生产应用。微卫星序列又称简单重复序列（SSR）、短串联重复序列，由若干个串联重复单元组成，每单元含1-10个核苷酸，广泛分布在真核生物基因组中（9-10）。SSR具有标记之间密度大、材料间多态性好、易扩增、重复性高等优点，已被广泛在水稻，玉米，小麦等作物上应用。SSR按来源分为两类genome-SSR和EST-SSR，随着EST数据库的不断丰富，EST-SSR被大量开发。截止目前，药用植物已有红花、丹参、党参、人参、西洋参、金银花等开发了EST-SSR，逐渐代替通用引物应用于遗传多样性、道地性鉴定等研究。近年来二代测序飞速发展，成本急剧降低。使得利用转录组测序开发EST-SSR成为一种便捷高效的手段。但目前还未有利用川芎转SSR标记引物的报道。因此，利用转录组数据批量开发川芎EST-SSR引物。该标记能直接用于川芎种质资源指纹图谱构建、遗传作图、基因定位和比较基因组学研究，对川芎品种的标准化、真伪品种的鉴定、分子标记辅助选择育种都有重要作用。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。本专利技术提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：148所示。本专利技术还提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：（1）对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；（2）利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；（3）利用Primer3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；（4）采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组。进一步的，步骤（2）中，SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。进一步的，步骤（3）中，引物设计时参数设置为：引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR扩增产物长度100-300bp。进一步的，步骤（4）中，PCR扩增的反应体系为：DNA2μL、5U·μL-1Tap酶0.2μL、10mmol·L-1引物2μL、2.5mmol·L-1dNTP2μL、25mM10×Buffer2μL、ddH2O11.8μL。进一步的，步骤（4）中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。本专利技术基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在川芎种质资源遗传多样性分析中的应用。本专利技术基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在鉴定川芎品种中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首次公开了川芎EST-SSR标记引物组，该引物经验证后得到多态性较高的74对EST-SSR，与通用引物相比，川芎EST-SSR标记引物组具有多态性高，易扩增，重复性好，结果更准确等优点，可用于后续川芎的遗传图谱构建、川芎品种指纹图谱构建等基础研究，促进川芎分子育种和功能基因发掘、中药品种标准化等应用研究。附图说明图1是本专利技术开发的EST-SSR标记引物组的UPGMA聚类图谱；图2是本专利技术利用引物对25得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图；图3是本专利技术利用引物对43得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图；图4是本专利技术利用引物对52得出的川芎样品扩增产物的毛细管电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细地解释说明。本专利技术的一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，其中，各引物的核苷酸序列如表1（序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：148）所示。一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：（1）拼接川芎转录组测序数据，得到通用基因库(unigene)；（2）利用MISA软件发掘川芎EST-SSR位点；（3）利用Primer3进行批量设计SSR引物；（4）挑选235对引物进行合成，对收集的川芎资源进行扩增、验证；（5）用NTSYS-pc2.l0e软件对川芎资源进行聚类分析，使用POPGENE对川芎各个引物多样性指数进行检测。实施例1本实施例制备川芎EST-SSR标记引物组，包括以下步骤：(1)川芎转录组数据的SSR引物获得（1.1）对川芎根转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene。（1.2）利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘，基本参数设置为单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。（1.3）采用Primer3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，参数设置为引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%；PCR扩增产物长度100-300bp。去重复后，得到设计出的引物共计3602个，合成其中的235对。（2）利用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，川芎材料如表2所示。用设计的EST-SSR引物对上述材料的DNA进行PCR扩增，用于验证引物设计的效率，同时筛选出多态性较高的核心引物。（2.1）取新鲜幼嫩的川芎叶片，采用CTAB提取法提取川芎DNA。（2.2）PCR扩增：总体积20μL，DNA2μL、Tap酶（5U·μL-1)0.2μL、引物（10mmol·L-1）2μL、dNTP(2.5mmol·L-1)2μL、10×Buffer(25mM)2μL、ddH2O11.8μL。扩增反应程序为：预变性94℃5min，34个循环（94℃变性30S，56℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min，降温到20℃，-4℃保存）。（2.3）PCR产物中加入5μL的dilutionbuffer，最后一孔加25μLDNALadde本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：148所示。2.一种获取权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；(2)利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；(3)利用Primer3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；(4)采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组。3.根据权利要求2所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(2)中，SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。4.根据权利要求2所述的基于川芎转录组序...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁灿，彭芳，杨泽茂，张超，钟文娟，杨晓，牟方生，龚一耘，蒲德强，戢沛城，叶霄，熊淼，黄海燕，
申请(专利权)人：四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51