SSR引物组及利用该引物组构建麦芽指纹图谱的方法技术

本发明专利技术提供了SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物。本发明专利技术还提供了一种利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：提取供试样品的DNA、用3条进行引物PCR扩增、毛细管电泳荧光检测、数据分析及图谱构建。利用上述麦芽标准指纹图谱可以进行麦芽品种的鉴定。本发明专利技术建立了毛细管电泳技术与SSR荧光标记相结合的高通道麦芽纯度鉴定方法，结果准确可靠，检测效率提高，杜绝麦芽掺假和售假行为出现，从源头上保障啤酒生产企业的产品质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术创造属于生物
，具体涉及一种构建麦芽指纹图谱的方法，尤其涉 及一种利用SSR引物构建麦芽指纹图谱，进而进行麦芽品种鉴定的方法。
技术介绍
啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的 低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，麦 芽的质量直接决定啤酒的质量。麦芽的品种鉴定是评价大麦质量和麦芽质量最重要的指 标，二者均是保证啤酒品质的重要指标。由于缺乏麦芽品种鉴定的技术手段，啤酒企业在麦 芽采购时不仅蒙受巨大的经济损失，而且掺假的麦芽由于均一性差，将直接影响糖化、过滤 和酿造性能，降低啤酒品质，最终影响啤酒企业的品牌形象。因此啤酒行业内急需开发一种 麦芽品种的鉴定技术，进而从源头上保障啤酒原料的品质。 近年来以微卫星（SSR)分子标记为基础的大麦、小麦等农作物DNA指纹库的构建 已逐步开展，基于聚丙稀酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)技 术在大麦遗传多样性及纯度鉴定等方面的研究也有相关报道。传统的SSR操作通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳（PAGE)配合银染分析进行基因多态性分析，方法成熟，却耗时、耗力、非自动 化，尤其是进行大规模、多批次的数据收集和分析时，该方法存在相当大的难度：（1)不能 准确读出扩增片段大小；（2)不同等位基因的变异难以准确识别；(3)不同批次反应数据难 以统一处理。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动 化、样品少、应用范围广等优点。毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE)是以弹性 石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配 行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳在检测时要求引物必须携带荧 光检测器能识别的荧光染料，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通 过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。专利技术专利ZL201310119954. X公开了"一种小麦SSR指纹图谱构建方法"。所述小麦SSR指纹图谱构建方法包括如下步 骤：首先提取供试品种的DNA，然后用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR 荧光标记引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经五色荧光毛细管电泳检测构 建小麦品种的SSR指纹图谱。该方法提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并 且鉴定结果不易受环境影响。然而，与普通引物仅30-50元的成本相比，目前10D荧光引物 的成本过高，约600-1000元。 TP-M13-SSR技术是基于荧光测序技术的SSR扩增产物检测体系，也是SSR技术与 荧光自动测序技术的完美整合。M13荧光引物具有通用性，只需合成一次。如果试验中需要 增加新的SSR引物时，只要合成普通引物即可，不用再合成新的荧光引物，因此试验成本大 幅降低。因此，TP-M13-SSR技术结合了SSR技术与荧光检测的优点--简便、可靠、低成本。 专利技术专利ZL201310127570. 2公开了"一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法"。该本 专利技术所述的构建方法，包括如下步骤：1)提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA ;2)以亲本 材料筛选SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为 模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图 谱。该专利技术建立了枣树SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有高效性、稳 定性和共显性等优点。但目前还未见关于应用基于毛细管电泳技术的SSR分子标记进行麦 芽品种鉴定的报道。
技术实现思路
针对目前麦芽品种鉴定缺少成本低、灵敏、准确定量检测手段的问题，本专利技术提 供了SSR引物组以及利用所述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，该方法基于 TP-M13-SSR标记结合毛细管电泳技术，并利用所构建的SSR指纹图谱进行麦芽品种鉴定。 本专利技术的技术方案是：SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssrl0148、HVM68、HVWAXYG和 EBmac755 ;其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引 物。所述4对核心SSR引物序列如下： 利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤： (1)提取供试样品的DNA: 取单粒麦芽样品于1. 5ml离心管中，约25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用Thmorgan CK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65°C预热的CTAB提取缓冲液600ul， 涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加 4ul0 -巯基乙醇和1 %PVP(聚乙烯吡咯烷酮），防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多 酚和多糖。65°C水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇（24:1)，涡旋剧烈 混匀20s，使成乳状液。室温下，lOOOOrpm离心10分钟，吸取300ul的上清液到新离心管中， 加10ul的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线 状DNA形成块状沉淀。-20°C条件下放置20分钟以上，lOOOOrpm离心3分钟收集沉淀。加 650ul的70%乙醇冲洗液，轻摇几分钟，lOOOOrpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放洁净场 所挥发乙醇。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8°C保存DNA。 (2)用3条引物PCR扩增： 第1条引物是SSR正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即 TP-M13引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是5'端标记有AlexaFluor 680荧光的M13通用引物。所述M13通用引物的引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT。 PCR体系反应体积为20yL，含MgCl2 2. 5mmol/L，dNTP 0? 20mmol/L，带有M13尾巴 序列的特异正向引物〇? 04ymol/L、反向引物0? 16ymol/L，M13荧光引物0? 12ymol/L，Taq DNA聚合酶0. 5单位，2XPCR缓冲液（不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94°C预变 性 3min;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸lmin，共 30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保 存。(3)毛细管电泳荧光检测： a、制备SLS/DSS混合液：取0? 5y1的DSS-400分子量内标，加入39. 5y1的SLS 甲酰胺上样缓冲液，在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中； b、样品孔中加入1y1稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品； c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液； d、将上样板和缓冲板放入BECKMANGeXP遗传分析系统仪（BECKMAN公司，美国） 中，进样电压2.OkV，时间30sec;90°C变性120sec;分离电压6.OkV，时间50min。在毛细管 凝胶电泳过程中，PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
SSR引物组，其特征在于：包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP‑M13引物；所述4对核心SSR引物序列如下：

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余俊红，尹花，张志军，岳杰，林艳，房莉，周月南，祁明霞，张翠，
申请(专利权)人：青岛啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37