一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种芦笋胆固醇C

【技术实现步骤摘要】
一种芦笋胆固醇C
‑
22羟化酶异源表达载体构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法。

技术介绍

[0002]目前，基因重组表达技术在当今的生物科学研究及产业化中有着越来越广泛的应用。目前，基因重组表达的宿主生物有很多种，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。很多情况下，在利用这些宿主生物表达目的基因时需要先在大肠杆菌中构建一个正确插入目的基因的环状质粒载体，将该载体提纯、线性化后再转化宿主生物，目的基因通过同源重组整合到宿主生物的基因组中，根据筛选基因可获得稳定表达的克隆子。比如常用毕式酵母(Pichia pastoris)的pPIC9K载体(Invitrogen)和中国仓鼠卵巢细胞CHO的pOptiVEC TM
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TOPO载体(Invitrogen)等均属此类。
[0003]中国专利申请案(中国专利申请号02116936.5、02117763.5和02123460.4)报道了三种无需克隆的线性化载体构建方法并且注重参与连接反应的末端的产生。每个专利技术中分别给出一种末端产生的方法，分别是以非对称性切割的限制性内切酶酶切产生末端、DNA和RNA杂交体的RNA突出末端作为末端、切口酶及核酸外切酶作用产生末端。带有相应末端的相当于载体的片段和目的基因由T4DNA连接酶催化产生连接反应从而构建无需克隆。
[0004]但是，现有表达载体的构建方法对连接反应效率较低且极易产生错误连接，同时在实际应用中受到一定的限制，未能进一步得到推广应用。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有表达载体的构建方法对连接反应效率较低且极易产生错误连接，在实际应用中受到限制而未能推广。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种AoCYP90B27基因，所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，即LOC109833124。
[0008]ATGGGAATGGAGCTTCTCTTAGGAATCTCTACGCTAATCATAGCTCTCATCATCTTCCTCGGTTTCCGTAGTAACGATAAACTCGACGGCAAATCCCTCAAGCTCCCTCCTGGAAACCTCGGCGGCTGGCCTCTCATCGGGGACACAATCCCCTTCATGCAGCCACATTCCTCGGCCTCTCTCGGCACTTTCATGGACCAACACATCGCCAAGTATGGGAGGATATTTAGGATGAATTTGTTGGGGAGGCCTACGATTGTGTCGGCGGACCCGGAGTTTAATCGGTTCATACTGCAGAGCGAGGGGAGGCTGTTCGAGAACAGTTGCCCGACGAGCATCGCCGAGATTATGGGGCGGTGGTCGATGCTGGCGCTGGCCGGTGACATACATAAGGAAATGAGGTCTATTGCCGTCAACTTTATGAACAATGTCAAGCTCCGGACTTATTTTCTGCCTGATGTAGATGCTCAGGCTGTTAAGATTCTTGATTCTTGGAAGGATAATACTACTTTCTCCGCGATGGAACAAGGGAAGAAGTTTGCGTTTAATTTGATGGTGAAGCAACTGATGAGCATGGATCCTGGAATGCCTGAGACGGAGCAGTTGAGGAGCGAGTACGTTTTCTTTATGAAGGGGATGGCTTCTATTCCTTTGAATTTGCCATGGACAGCCTTCA
GAAGGGCCTTGCAGTCGAGATCCGCAATCCTGAAGATTATGGGACAAAAGCTAGACGAGAGAGTGCGAAAACTTCAAGAGGGAGTCCAAGGACTCGAAGAAGACGATCTCCTTGCATCGGTCGCAAAGCACCCACATCTAACGAGAGATCAGATTCTTGATTTGATACTGAGCATGCTCTTCGCTGGTCACGAGACCTCATCTGCTGCCATCTCGTTAGCTATTTACTTCCTGCAGTCCTCGCCCAAAGTCCTGCAACAGTTGCGAGAAGAGCACACTAAGATTGCGAATCAGAAGAAGGAACGAGGCGAAACTGGATTGAATTGGGATGATTACAAGCAAATGGAGTTCACCCATTGTGTTATTAATGAAACTCTAAGGCTGGGAAACATTGTGAAGTTCTTGCACAGAAAGGCCCTTAAAGATGTGCAGTTCAAAGGATATGATATTCCATGTGGTTGGGAAGTAGTGCCAATAATCTCTGCAGCACATTTGGATTCAGCAATTTACGATGACCCACAAATTTACAACCCCTGGAGATGGGAGACGATCTTTGCGACGATGACGAAGAACAGCAACGTAATGTCGTTCAGCGGGGGCCCTCGGCTTTGCCCGGGAGCAGAGCTGGCGAAGCTGGAGATGGCGGTGTTTCTTCACCATTTGGTGCAGAGGTTCGAGTGGGAGCTGGCCGAGCACGACTATCCTGTTTCCTTCCCTTTCCTTGGATTCCCCAAGCAACTCCCCATCAAGATTCGTGCTCTTAAGTAA。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的AoCYP90B27基因构建得到的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法，所述芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，AoCYP90B27基因的克隆：以多年生芦笋根部组织提取总RNA，以芦笋cDNA为模板进行CDS扩增，测序，比对；
[0012]步骤二，AoCYP90B27片段克隆：以送测序的PET
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AoCYP90B27 T载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；
[0013]步骤三，Pcfp
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AoCYP90B27表达载体构建：对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒；
[0014]步骤四，Pcp
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AoCYP90B27
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gpd terminator载体构建：利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒。
[0015]进一步，所述步骤一中的RNA的提取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AoCYP90B27基因，其特征在于，所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。2.一种应用如权利要求1所述的AoCYP90B27基因构建得到的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体。3.一种应用如权利要求2所述的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤：步骤一，AoCYP90B27基因的克隆：以多年生芦笋根部组织提取总RNA，以芦笋cDNA为模板进行CDS扩增，测序，比对；步骤二，AoCYP90B27片段克隆：以送测序的PET
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AoCYP90B27T载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；步骤三，Pcfp
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AoCYP90B27表达载体构建：对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒；步骤四，Pcp
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AoCYP90B27
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gpdterminator载体构建：利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒。4.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤一中的RNA的提取包括：以多年生芦笋根部组织根据天根RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，根据天根反转录试剂盒制备cDNA于
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20℃保存备用。5.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤一中的AoCYP90B27基因的克隆包括：以芦笋cDNA为模板，根据AoCYP90B27 CDS设计特异性扩增引物AoCYP90B27 F和AoCYP90B27 R进行CDS扩增，扩增产物进行胶回收，并连接到T载体进行测序后，将测序结果与原序列进行核苷酸序列比对。6.如权利要求3所述的芦笋胆固醇C
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22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤二中的AoCYP90B27片段克隆包括：以送测序的PET
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AoCYP90B27 T载体为模板，用引物Pcfp
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AoC...

【专利技术属性】
技术研发人员：林春，刘正杰，董玉梅，毛自朝，张永辉，黄玲，成钦，黎玉萍，吴贺，
申请(专利权)人：四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，
类型：发明
国别省市：