一种基于多重HRM分析的氯吡格雷耐药基因检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于多重HRM分析的氯吡格雷耐药基因检测方法，所述的方法的引物如SEQ ID NO:1～10所示。本发明专利技术还提供HRM分析涉及的引物组合、试剂盒。其优点表现在：本发明专利技术建立了一种针对多个SNP位点的HRM分型的方法，可以在同一个反应体系中检测rs4244285、rs4986893、rs12248560三个位点，和/或rs1045642、rs662两个位点，减少了试剂用量，缩短了检测时间。使用本发明专利技术的方法对经皮冠状动脉介入造影手术的病人的样本进行检测，并用Sanger测序方法进行验证，准确率高。

A detection method of clopidogrel resistance genes based on multiple HRM analysis

The invention relates to a detection of clopidogrel resistance genes by multiple HRM analysis method based on the method of primers such as SEQ ID NO:1 ~ 10 shows. The invention also provides primer combinations and kits involved in HRM analysis. Its advantages are that the invention provides a method for multiple loci of SNP HRM type, rs4244285, rs4986893, rs12248560 can detect three loci in the same reaction system, and / or rs1045642, rs662 two sites, reducing the amount of reagent, shorten the detection time. The method is used for detecting the samples of patients undergoing coronary arteriography, and the method is verified by Sanger sequencing method, and the accuracy is high.

【技术实现步骤摘要】
一种基于多重HRM分析的氯吡格雷耐药基因检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体地说，是一种基于多重HRM分析的氯吡格雷耐药基因检测方法。
技术介绍
氯吡格雷用于治疗冠心病患者经皮冠状动脉介入术(percutaneouscoronaryintervention，PCI)后预防血栓事件。临床应用时4％～30％患者在常规剂量治疗中达不到预期的抗血小板作用，严重者会导致再次心梗、血栓、死亡等心血管不良事件，这种现象称为氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，CR)。氯吡格雷是一种前体药物，在体外无活性，通过酶促反应衍生成硫醇代谢物而发挥临床疗效。影响药物转化的相关基因主要包括影响药物吸收的ABCB1和影响代谢过程的肝药酶代谢酶基因。在氯吡格雷的代谢过程中CYP2C19发挥至关重要的作用，CYP2C19基因存在多态性，其中慢代谢型以CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)变异为主，分别导致了酶失去催化活性和活性降低；CYP2C19*17(rs12248560)突变则显著升高了2C19的转录活性，是一种超快速代谢的基因表型。PON1酶是氯吡格雷代谢过程中的关键酶，控制着2-O-氯吡格雷生成活性产物，PON1Q192R(rs662)基因多态性可能影响血小板的聚集。编码小肠多耐药P-糖蛋白的ABCB1基因多态性会影响氯吡格雷的生物利用度，ABCB13435C＞T(rs1045642)与十二指肠P-gp高表达以及P-gp底物生物利用度降低有关。因此，建议在使用氯吡格雷前进行CYP2C19、PON1和ABCB1基因检测，依据患者基因型确定合适给药方案。高分辨熔解曲线(high-resolutionmelt,HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品基因型的分析。中国专利文献CN104450935A公开了一种HRM技术检测氯吡格雷用药相关基因多态性的方法。中国专利文献CN105018583A公开了一种华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其应用，可用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的多态性位点。中国专利文献CN105671165A公开了一种基于SequenomMassARRAY分型系统的检测与氯吡格雷药物抵抗反应相关的基因位点高效分型的试剂盒。但是临床医疗检测的准确性至关重要，而基于HRM技术的高通量检测由于同一反应体系中引物较多，外加其他反应成分，往往检测准确率较低，因此提供一种能同时检测多个位点并且准确率很高的氯吡格雷耐药基因检测引物及方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合。本专利技术的再一的目的是，提供一种基于多重HRM分析的氯吡格雷耐药基因检测方法。本专利技术的另一的目的是，提供氯吡格雷耐药基因检测的引物组合的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其用于检测rs4244285、rs4986893、rs12248560三个位点，rs4244285位点的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，rs4244285位点的下游引物序列如SEQIDNO:2所示；rs4986893位点的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，rs4986893位点的下游引物序列如SEQIDNO:4所示；rs12248560位点的上游引物序列如SEQIDNO:5所示，rs12248560位点的下游引物序列如SEQIDNO:6所示。一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其用于检测rs662、rs1045642两个位点，rs662位点的上游引物序列如SEQIDNO:7所示，rs662位点的下游引物序列如SEQIDNO:8所示；rs1045642位点的上游引物序列如SEQIDNO:9所示，rs1045642位点的下游引物序列如SEQIDNO:10所示。一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其用于检测rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs662、rs1045642位点，rs4244285位点的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，rs4244285位点的下游引物序列如SEQIDNO:2所示；rs4986893位点的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，rs4986893位点的下游引物序列如SEQIDNO:4所示；rs12248560位点的上游引物序列如SEQIDNO:5所示，rs12248560位点的下游引物序列如SEQIDNO:6所示；rs662位点的上游引物序列如SEQIDNO:7所示，rs662位点的下游引物序列如SEQIDNO:8所示；rs1045642位点的上游引物序列如SEQIDNO:9所示，rs1045642位点的下游引物序列如SEQIDNO:10所示。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种检测氯吡格雷耐药基因的HRM分析方法，所述的方法包括以下步骤：对DNA样品进行PCR扩增，PCR反应结束后，对反应体系缓慢程序升温，升温过程中记录荧光信号，获得高分辨率熔解曲线。优选地，PCR扩增反应在荧光定量PCR分析仪内进行，PCR扩增的条件为：95℃预变性3min，然后进行35个反应循环，每个循环包括95℃、15s的变性，和30s的退火延伸，检测rs4244285、rs4986893、rs12248560三个位点的退火延伸温度为60℃，检测rs662和rs1045642两个位点的退火延伸温度为62℃。优选地，在荧光定量PCR分析仪内对反应体系进行缓慢程序升温，温度每上升0.2℃记录一次荧光信号。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的引物组合在制备多重HRM分析的试剂或试剂盒中的应用。所述的试剂或试剂盒用于检测氯吡格雷耐药基因。一种基于多重HRM分析的氯吡格雷耐药基因检测的试剂盒，所述的试剂盒包含镁离子、dNTP、rTaq酶、Syto9染料、碱基序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示的引物，前六种引物与后四种引物分开设置。本专利技术优点在于：1、本专利技术的检测方法是针对多个SNP位点的HRM分型方法，用以分析与氯吡格雷精准用药相关的5个SNP位点rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs662和rs1045642。2、本专利技术的检测方法可以在同一个反应体系中检测rs4244285、rs4986893、rs12248560三个位点，和/或rs1045642、rs662两个位点，减少了试剂用量，缩短了检测时间。3、本专利技术的检测方法对316个经皮冠状动脉介入造影手术的病人的样本进行检测，并用Sanger测序方法进行验证，rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1045642和rs662本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其特征在于，其用于检测rs4244285、rs4986893、rs12248560三个位点，rs4244285位点的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，rs4244285位点的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；rs4986893位点的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，rs4986893位点的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；rs12248560位点的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，rs12248560位点的下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其特征在于，其用于检测rs4244285、rs4986893、rs12248560三个位点，rs4244285位点的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，rs4244285位点的下游引物序列如SEQIDNO:2所示；rs4986893位点的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，rs4986893位点的下游引物序列如SEQIDNO:4所示；rs12248560位点的上游引物序列如SEQIDNO:5所示，rs12248560位点的下游引物序列如SEQIDNO:6所示。2.一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其特征在于，其用于检测rs662、rs1045642两个位点，rs662位点的上游引物序列如SEQIDNO:7所示，rs662位点的下游引物序列如SEQIDNO:8所示；rs1045642位点的上游引物序列如SEQIDNO:9所示，rs1045642位点的下游引物序列如SEQIDNO:10所示。3.一种用于HRM分析法检测氯吡格雷耐药基因的引物组合，其特征在于，其用于检测rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs662、rs1045642位点，rs4244285位点的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，rs4244285位点的下游引物序列如SEQIDNO:2所示；rs4986893位点的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，rs4986893位点的下游引物序列如SEQIDNO:4所示；rs12248560位点的上游引物序列如SEQIDNO:5所示，rs12248560位点的下游引物序列如SEQIDNO:6所示；rs662位点的上游引物序列如SEQIDNO:7所示，rs662位点的下游引物序列如SEQIDNO:8所示；rs1045642位点的上游引物序列如SEQIDNO:9所示，rs...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅启华，张立辰，张晓青，游国岭，杨海鸥，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海,31