动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片制造技术

本发明专利技术提供了动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片。本发明专利技术提供了用于鉴定动物源食品致病菌、致病菌耐药基因和/或致病菌毒力基因的探针，由序列1‑序列171所示的单链DNA分子组成。本发明专利技术实验结果表明：本发明专利技术的动物源食品中致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片，能够有效的达到同时鉴定细菌及其毒力和耐药基因的综合目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片。
技术介绍
动物源食品中致病菌导致的疾病一直是发展中国家和发达国家广泛关注的公共卫生问题之一。控制食品污染和食源性疾病被世界卫生组织(WHO)列为优先战略领域范畴。我国作为最大的发展中国家，食源性疾病监测网的建立尚不健全。近年来，微生物病原菌是导致食源性疾病爆发的主要原因之一。各种食源性病原菌自身的生物毒素与细菌的致病力密切相关，与此同时，其中很多毒力基因也可以作为食源性致病菌的鉴别基因。随着食源性病原菌中耐药基因在人畜之间的传播，直接影响了人们对治疗食源性病原菌疾病的治疗效果。因此，综合针对食源性病原菌病原鉴定，及其主要毒力基因和耐药基因三个方面的鉴定，建立一套系统，快捷，高通量的检测办法，可以有效地促进我国公共卫生事业的发展。目前，分别针对动物源食品中致病菌鉴定、毒素鉴定、耐药鉴定的传统生物生化方法，试验周期长，实验室工作量大、个别试验检测灵敏度低。综合以上特点，不能高效准确地应对公共卫生突发性事件。目前，NCBI数据库已经建立了多种病原微生物基因组和耐药基因序列数据信息。20世纪90年代专利技术基因芯片技术，将寡核苷酸分子固定于固相载体上，形成DNA微阵列，将样品核酸荧光标记，与芯片探针杂交，通过芯片分析系统获得大量检测信息；该项技术具有微型化，高通量，高准确性，高灵敏度的技术优点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是一种提供鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的成套探针。本专利技术提供的成套探针，由序列1-序列171所示的单链DNA分子组成。上述探针中，所述成套探针中每条探针的5’末端均为氨基化修饰。上述探针中，所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的成套探针，由序列1‑序列171所示的单链DNA分子组成。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的成套探针，由序列1-序列171所示的单链DNA分子组成。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述成套探针中每条探针的5’末端均为氨基化修饰。3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsaE、lsaB、lsaC、vgaA、vgaB、vgaC、vgaD、vgaE中至少一种；所述磺胺和甲氧苄啶类耐药基因为sul1、sul2、sul3、dfr1、dfr6、dfr12、dfr17、dfrA、dfrG、dfrK中至少一种；所述多耐药基因为cfr、oqxA、oqxB中至少一种；所述动物源食品致病菌特异基因和毒力基因为：沙门氏菌(Salmonella)invA和fimY特异基因、hilA毒力基因、鼠伤寒沙门血清型特异基因、肠炎沙门氏菌血清型特异基因、鸡沙门氏菌血清型特异基因、阿贡那沙门氏菌血清型特异基因、猪霍乱沙门氏菌血清型特异基因；肠球菌(Enterococcus)asal、gelE、cylA、esp、hyl毒力基因，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rRNA和菌株特异基因、屎肠球菌(Enterococcus faecium)16S rRNA和菌株特异基因、侵袭性大肠杆菌EIEC(enteroinvasive E.coli)virF、侵袭性质粒抗原ipaH基因；出血性大肠杆菌EHEC O157(enterohemorrhagic E.coli O157)stx1、stx2、eae、O157抗原rfbE基因；志贺氏菌属(Shigella spp.)侵袭性质粒抗原ipaH基因；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)cpa毒力基因；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)16S rRNA、rpoB基因和cytK、bceT、HBL毒力基因；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)16S rRNA和nuc基因；单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的16S rRNA和hly毒力基因；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ail、yst毒力基因和16S rRNA基因；弯曲菌(Campylobacter)16S rRNA基因；结肠弯曲菌(Campylobacter coli)asp菌株特异基因；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)hip菌株特异基因；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)16S rRNA和ompW菌株特异基因；霍乱毒素ctxA毒力基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)16S rRNA基因、toxR和t l菌株特异基因、tdh、trh毒力基因；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)16S rRNA基因；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)16S rRNA和aerA毒力基因；变形杆菌(Proteus spp.)16S rRNA中至少一种。4.一种于鉴定或辅助鉴定待测菌是否为动物源食品致病菌或待测菌是否含有动物源食品致病菌耐药基因和/或动物源食品致病菌特异基因和/或动物源食品致病菌毒力基因的基因芯片，为将权利要求1-3中任一所述的探针固定在芯片上，得到基因芯片。5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于：所述动物源食品致病菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠球菌(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、弧菌(Vibrio)、弯曲菌(Campylobacter)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、变形杆菌属(Proteus spp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种；和/或，所述沙门氏菌(Salmonella spp.)具体为鼠伤寒沙门(S.Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、阿贡那沙门氏菌(S.Agona)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)中的至少一种；和/或，所述大肠杆菌(E.coli)具体为EHEC肠出血性O157、EIEC侵袭性大肠杆菌中的至少一种；和/或，所述弧菌(Vibrio)具体为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的至少一种；和/或，所述弯曲菌(Campylobacter)具体为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)中的至少一种；和/或，所述肠球菌(Enterococcus)具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)中的至少一种；所述动物源食品致病菌耐药基因为：β内酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、林可酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、四环素耐药基因、氯霉素类耐药基因、糖肽类耐药基因、截短侧耳素类耐药基因、磺胺和甲氧苄啶类耐药基因和多耐药基因中的至少一种；所述β内酰胺类耐药基因为mecA、CMY、CTX-M、DHA、IMP、KPC、OXA、PER、TEM、VIM、NDM、SHV、PSE中至少一种；所述氨基糖苷类耐药基因为aac(3)-II、aac(3)-Iva、aac(6')-aph(2″)、aac(6')-Ib、aadA、aadD、ant(6)-I、armA、strA、strB中至少一种；所述大环内酯类耐药基因为灭活酶ereA、ereB、外排泵mefA、甲基化酶ermA、ermB、ermC、ermF、mphA中至少一种；所述林可酰胺类耐药基因为lnuE、lnuB、lnuA、msrA，喹诺酮类耐药基因：NorA、qnrB、qnrA、qnrS、qepA、qnrC、qnrD中至少一种；所述四环素耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetO、TeA(P)、tetM、TetS中至少一种；所述氯霉素类耐药基因为catA1、catA2、catA3、catA7、catA8、catA9、catB1、catB2、catB3、catB4、catB5、cmlA、floR、fexA、fexB中至少一种；所述糖肽类耐药基因为vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanZ、vanM中至少一种；所述截短侧耳素类耐药基因为lsaA、lsa...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴聪明，崔明全，汪洋，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11