本发明专利技术涉及获得了对甜菜夜蛾具有高活性的Vip3Aa11蛋白突变体，属于生物技术领域。本发明专利技术将Vip3Aa11蛋白氨基酸序列上686位点的丝氨酸(Ser)突变成精氨酸(Arg)，获得的突变体蛋白S686R对甜菜夜蛾的毒杀效果在原有高活力的基础上提高了8.96倍，有效的克服寻找苏云金芽孢杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力基因的难题、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物防治
，具体涉及对鳞翅目农业害虫具有高毒力的Bt杀虫基因的定点突变及由该基因所编码的蛋白质。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，它是一种对人畜无害的昆虫病原微生物，是目前研究最为深入、应用最成功的微生物杀虫剂。营养期杀虫蛋白(VIPs)是一种在Bt在营养期分泌的一类新型杀虫毒蛋白，它对鳞翅目、鞘翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性，该蛋白的发现使得Bt杀虫剂在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破，在一定程度上克服了许多害虫对Bt内毒素低敏感或不敏感的弊端。近年来一些研究表明，VIP蛋白上某些氨基酸区域与杀虫活性及特异性有关。Selvapandiyan等(Selvapandiyan A,Arora N,Rajagopal R,et al.Applied and Environmental Microbiology[J],2001,67(12):5855-5858.)的研究表明缺失Vip蛋白N端的39个氨基酸残基不影响其对蛀茎斑螟Chilo partellus的杀虫活性，但是对斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)的活性显著降低，而缺失C端的154个氨基酸残基导致Vip蛋白对斜纹夜蛾完全丧失活性，对蛀茎斑螟的杀虫活性轻微下降。Chen等(Chen J,Yu J,Tang L,et al.Journal of Applied Microbiology[J],2003,95(2):310-316.)将vip3A-S184基因5′端信号肽编码区的81个核苷酸进行缺失突变后，表达的突变体蛋白在细胞质内形成包涵体，且对甜菜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾完全丧失活性。相比之下，Gayen等(Gayen S,Hossain M A,Sen S K.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology[J].2012,21(S1):128-135.)报道Ndv200(缺失Vip3BR N端的200个氨基酸残基)对棉铃虫、小地老虎、海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis和三化螟Scirpophaga incertulas的毒力增强了2～3倍，而Cdv200完全失去毒力，Cdv127则维持了对棉铃虫和小地老虎较低水平的杀虫活性。Dong等(Dong F,Zhang S,Shi R,et al.Current Microbiology[J],2012,65(5):583-588.)基于Vip3蛋白在敏感昆虫肠液或Trypsin的作用下能水解成62k Da的毒性核心功能区。将Vip3Aa7蛋白的3个位于62kDa核心功能区的高度保守的半胱氨酸(Cys)残基替换成丝氨酸残基(Ser)(Dong F,Zhang S,Shi R,et al.Current Microbiology[J],2012,65(5):583-588.)，结果显示，突变蛋白C292S对小菜蛾的杀虫活性降低、，而C507S和C401S对小菜蛾完全丧失杀虫活性。上述研究结果充分说明了VIP蛋白的N端和C端对于杀虫活性的发挥起到了举足轻重的作用，但VIP蛋白对甜菜夜蛾杀虫特异性相关氨基酸区域尚无明确报道，且多数突变体为多点突变且活性大多丧失，通过单点突变提高新活的成功案例较少。
技术实现思路
针对上述领域中的缺陷，本专利技术采用单点突变的方法，将Vip3Aa11蛋白氨基酸序列上686位点的丝氨酸(Ser)突变成精氨酸(Arg)，获得的突变体蛋白S686R对甜菜夜蛾的毒杀效果提高了8.96倍，有效的克服寻找苏云金芽孢杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力基因的难题、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。突变体vip3Aa11-S686S，其具有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。编码上述突变体vip3Aa11-S686S的基因序列。所述的基因序列如SEQ ID NO2所示。上述突变体vip3Aa11-S686S在杀灭甜菜夜蛾害虫中的应用。所述应用为将权利要求1所述的突变体vip3Aa11-S686S制成杀虫剂杀灭甜菜夜蛾。本专利技术采用定点突变技术将Vip3Aa11蛋白686位点的丝氨酸(Ser)突变成精氨酸(Arg)，获得了高活性的Vip蛋白突变体。实验表明，突变体vip3Aa11-S686S对甜菜夜蛾的杀虫活性提高8.9倍左右。附图说明图1突变原理示意图，图2引物设计原理图，图3 vip3Aa11突变基因的PCR鉴定结果，其中1：vip3Aa11突变基因；2：vip3Aa11-S686R突变基因；CK-：阴性对照，图4 vip3Aa11和突变体基因在大肠杆菌(BL21)中表达结果，其中1：Vip3Aa11原蛋白；2：Vip3Aa11-S686R突变蛋白具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。1.材料与试剂1.1菌株与质粒实验所用菌株与质粒详见表1，可以对公众发放。表1菌株与质粒331.2引物参考GenBank公布的已知vip3Aa11基因序列，设计全长引物一对V3-F/V3-R。构建单点突变体引物一对Modvip3Aa11-S686S-F/Modvip3Aa11-S686S-R。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表2 PCR鉴定引物及突变引物序列1.3供试昆虫甜菜夜蛾室内敏感种群标准试虫，购自河南省济源白云实业有限公司。1.4酶与生化试剂突变试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；DNAmarker购自北京康为世纪生物科技有限公司；Taq Mix聚合酶和蛋白Marker均购自TaKaRa公司；抗生素购自纳川生物技术公司；其它试剂均为市售国产或者进口分析纯或电泳级纯化学试剂。蛋白高分子量标准：Protein Standard(High range)(kDa)：200、116、97、66、44DM2000DNA Marker(bps)：5000、3000、2000、1000、750、500、250、1001.5培养基与抗生素液体LB培养基：trytone 1％，yeast extract 0.5％，NaCl 1％，pH 7.0，121℃/20mim灭菌。固体LB培养基：在液体培养基中加入1.3％琼脂，121℃/20mim灭菌。抗生素：硫酸卡那霉素水溶液100mg/mL用时稀释1000倍，-20℃保存。1.6其它试剂(1)20mM Tris-HCLTris-base 2.42g超纯水定容至1000mL，121℃/20mim灭菌后，用HCL将pH调至8.0(2)1.0mol/L IPTGIPTG 1.2g，超纯水配制x5mL，-20℃保存(3)0.1g/mL ApsAps 0.1g超纯水定容至1mL，充分混匀，现用现配。(4)0.1mg/mL SDSSDS 0.1g超纯水定容至1mL，充分混匀，现用现配。。(5)30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺 本文档来自技高网...
【技术保护点】
突变体vip3Aa11‑S686S，其具有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.突变体vip3Aa11-S686S，其具有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的突变体vip3Aa11-S686S的基因序列。3.权利要求2所述的基因序列如SEQ ID ...
【专利技术属性】
技术研发人员：高继国，刘荣梅，李海涛，雒国兴，张杰，宋福平，束长龙，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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