用于调控整合酶及耐药基因盒表达的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于调控整合酶及耐药基因盒的表达的siRNA及其应用，本发明专利技术设计的siRNA导入耐药菌菌株，沉默和干扰整合子系统中整合酶基因对耐药基因盒的捕获及耐药基因的表达。通过RT‑PCR定量检测整合酶基因mRNA表达水平的变化、微生物耐药性检测和整合酶整合效率检测等方法对siRNA的干扰效率进行评估，最终达到通过本发明专利技术siRNA控制和消除整合子引起的病原微生物耐药问题。本发有可以高效特异性地干扰整合酶和耐药基因的表达来达到抑制细菌耐药性，为新药开发开阔新的思路。

SiRNA for regulating the expression of integrase and resistance gene cassettes and uses thereof

The invention discloses a method for integration of enzyme and resistance gene cassette regulation of expression of siRNA and the application of siRNA into drug resistant bacteria strains were designed by the invention, the expression of resistance gene to capture and gene silence and resistance gene cassettes integrated in the subsystem of integrated interference. Assessment by RT quantitative detection of PCR integrase gene mRNA expression and microbial resistance detection and integrase integration efficiency of detection methods for siRNA interference efficiency, and ultimately achieve the invention of siRNA control and elimination of pathogens caused by drug resistant integron. The present invention can effectively and specifically interfere with the expression of integrase and resistance genes to inhibit bacterial drug resistance and open new ideas for the development of new drugs.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于对整合酶及耐药基因盒的表达调控因子siRNA及其应用。
技术介绍
食品安全性与食源微生物污染问题，仍然是食品科学中古老又具有挑战性的课题。所谓微生物耐药性是指对通常能抑制其生长繁殖的某种浓度的抗菌药物产生了耐受性。这一概念在20世纪50年代被提出，距第一个抗生素——青霉素临床应用仅仅4年时间。携带耐药因子的细菌可通过肥料、饲料及食品等在动植物、微生物和人类之间传播，但耐药性通过食物链传播给人类被认为是引起人类致病菌耐药的主要原因。人类通过不断研制出新抗菌药物来抑制和消除细菌日益增长的复杂耐药性，但是伴随着新抗菌药物的临床应用新耐药菌株也开始出现。细菌耐药的不断传播和不可消灭性使得它对人类生存健康和生产生活造成极大危害。细菌耐药的主要生化机制包括：(1)微生物通过产酶对抗生素修饰或破坏；(2)阻碍抗生素向细菌内渗透；(3)细菌主动外排机制；(4)靶位改变或新靶位产生。细菌耐药的生化机制是在细菌耐药基因机制指导下进行的[2]。以往关于细菌耐药性基因机制机理的研究局限在基因突变和由质粒介导的耐药性两个方面，但是用极低的细菌基因突变率和质粒介导的不稳定性来解释耐药性的快速发展和普遍性是不够确切的。近来，具有捕获及表达外来基因能力的整合子系统作为细菌耐药性机制正越来越引起研究者们的关注。整合子是由一个编码整合酶(integrase)的intI基因，二个基因重组位点attI和attC及一个启动子构成。整合酶在整合子中起重要作用，整合酶可以催化耐药基因盒的整合和剔除，使得耐药基因盒在不同整合子中进行重组。由于整合子结构存在于多种细菌中，特别是致病菌和临床菌株，整合酶使不同耐药基因在同种细菌和不同细菌中传播而逐渐提高了细菌的耐药性，导致细菌向耐药方向进化，对人类健康造成很大潜在危害，因此，对整合酶及耐药基因盒的表达调控因子进行研究，寻找沉默其基因表达的方法对控制和解决整合子引起的耐药问题具有重大理论及应用价值。基因沉默主要有两种情况：一种是转录水平上的基因沉默(transcriptionalgenesilencing，TGS)；另一种为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发展起来的转录后基因阻断技术[7]。RNA干扰是指双链RNA(double-strandRNA，dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，关闭相应基因的表达，从而引发基因转录后基因沉默的现象[8]。虽然在不同有机体内有着细节性的差别，但RNAi的作用机制是高度保守的，通常包含两个阶段：(1)起始阶段：内源性或外源性dsRNA被酶识别并切割成为片断大小在21-23nt的小分子干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)；(2)效应阶段：siRNA与核酸酶复合物结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，后者具有核酸内切酶活性，特异性的降解siRNA通过碱基互补原则识别同源靶mRNA。RNAi是一种非常有效的降低基因表达方法，但在早期，RNAi应用限制在植物及动物秀丽线虫和果蝇中，这是由于这些生物中长链dsRNA能有效诱导基因特异性沉默。在哺乳动物中长于30nt的dsRNA会抑制未分化细胞中特异基因的表达，而在分化细胞中又可以通过激活抗病毒防御机制诱导产生PKR、IFNs等，导致RNA转录产物非特异性降解和蛋白合成完全停止。随后这一问题通过直接体外合成21nt的dsRNA作用中间体——siRNA而得以突破。短链siRNA可以诱导基因特异性抑制反应，又能避免宿主干扰素反应。这一发现使得siRNA技术在哺乳动物中得以广泛应用。RNAi具有高特异性、高速性、高稳定性、高效性等优点。早期研究者一直认为RNAi现象只存在于真核生物，直到2006年初日本学者Katsunori等人用化学合成的siRNA抑制金黄色葡萄球菌凝血酶表达之后，人们才认识到RNAi机制也存在于原核生物中。中国是抗生素使用大国，控制和解决细菌耐药问题关系到人类生存健康和经济发展。以大肠杆菌耐药性的变化为例，对过去几十年里食品中大肠杆菌的耐药性测定，数据显示，食品中大肠杆菌耐药性呈逐渐增长的趋势。
技术实现思路
为了解决上述存在的问量，本专利技术提供了小分子干扰RNA(siRNA)的序列，可将这些siRNA导入耐药菌株沉默和干扰整合子中整合酶基因对耐药基因盒的捕获及耐药基因的表达。本专利技术的目的在于提供用于调控整合酶及耐药基因盒的表达的siRNA及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：用于调控整合酶及耐药基因盒表达的siRNA，所述siRNA为siRNA-I和siRNA-II；所述siRNA的序列分别为：siRNA-I：siRNA-I正义链：5’-GCUGAAAGGUCUGGUCAUATT-3’(SEQIDNO：1)，siRNA-I反义链：5’-UAUGACCAGACCUUUCAGCTT-3’(SEQIDNO：2)，siRNA-II：siRNA-II正义链：5’-CCCGUUCCAUACAGAAGCUTT-3’(SEQIDNO：3)，siRNA-II反义链：5’-AGCUUCUGUAUGGAACGGGTT-3’(SEQIDNO：4)。上述所述siRNA在降低耐药微生物耐药性中的应用。进一步的，上述所述耐药微生物为含有整合酶基因和耐药基因盒的耐药微生物。进一步的，上述所述耐药微生物为含有整合酶基因和耐药基因盒的耐药大肠杆菌。进一步的，上述所述整合酶基因选自intI1、intI2、intI3。进一步的，上述所述耐药基因盒选自aad、aac、dfr、bla、oxa、cat、ere、sat、grr、str。上述所述siRNA在制备抗耐药微生物药剂中的应用。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术率先采用RNAi技术来解决细菌耐药性的根本(整合酶及耐药基因盒的表达)，通过本专利技术特定的siRNA，可以高效特异性地干扰整合酶和耐药基因的表达来达到抑制细菌耐药性，为新药开发开阔新的思路。2)本专利技术解决了RNA干扰技术在原核微生物实际操作中的困难，为该技术的广泛应用开辟道路。3)本专利技术以本实验室已经检测到的整合子介导的耐药病原微生物为基础，通过设计特定的小分子干扰RNA(siRNA)干扰整合酶基因表达和耐药基因盒表达。将本专利技术设计的siRNA导入耐药菌菌株，沉默和干扰整合子系统中整合酶基因对耐药基因盒的捕获及耐药基因的表达。通过RT-PCR定量检测整合酶基因mRNA表达水平的变化、微生物耐药性检测和整合酶整合效率检测等方法对siRNA的干扰效率进行评估。最终达到通过本专利技术siRNA控制和消除整合子引起的病原微生物耐药问题。本专利技术从基因水平探讨病原微生物耐药的调控机制，其研究结果不仅有助于了解由整合子介导的病原微生物耐药遗传背景，而且也可为RNA干扰技术应用于原核生物及开发新型抗菌药物提供科学依据。附图说明图1为pGPU6siRNA表达载体的图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1、siRNA本专利技术通过前期大量的实验研究和筛选，最终发现2种siRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于调控整合酶及耐药基因盒表达的siRNA，所述siRNA为siRNA‑和siRNA‑；所述siRNA的序列分别为：siRNA‑：siRNA‑正义链：5’‑GCUGAAAGGUCUGGUCAUATT‑3’（SEQ ID NO：1），siRNA‑反义链：5’‑UAUGACCAGACCUUUCAGCTT‑3’（SEQ ID NO：2），siRNA‑：siRNA‑正义链：5’‑CCCGUUCCAUACAGAAGCUTT‑3’（SEQ ID NO：3），siRNA‑反义链：5’‑AGCUUCUGUAUGGAACGGGTT‑3’（SEQ ID NO：4）。

【技术特征摘要】
1.用于调控整合酶及耐药基因盒表达的siRNA，所述siRNA为siRNA-和siRNA-；所述siRNA的序列分别为：siRNA-：siRNA-正义链：5’-GCUGAAAGGUCUGGUCAUATT-3’（SEQIDNO：1），siRNA-反义链：5’-UAUGACCAGACCUUUCAGCTT-3’（SEQIDNO：2），siRNA-：siRNA-正义链：5’-CCCGUUCCAUACAGAAGCUTT-3’（SEQIDNO：3），siRNA-反义链：5’-AGCUUCUGUAUGGAACGGGTT-3’（SEQIDNO：4）。2.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊仁，闫鹤，石磊，李春海，郭先霞，
申请(专利权)人：广东石油化工学院，
类型：发明
国别省市：广东;44