双孢蘑菇诱导型启动子和表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双孢蘑菇诱导型启动子和表达载体及其应用。该启动子名称为pAbP3，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术还公开了含有该启动子的重组载体、宿主菌、转化子和启动子在双孢蘑菇转基因工程中的应用。该启动子可以在SA、ABA诱导条件下，驱动外源基因在双孢蘑菇中的诱导表达，能代替组成型启动子，对于双孢蘑菇品质的遗传改良和发酵代谢产物的调控具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种双孢蘑菇诱导型启动子和表达载体及其应用。
技术介绍
双孢蘑菇（Agaricusbisporus）是一种重要的世界性栽培蘑菇。它不仅味道鲜美、营养丰富，是一种深受人们喜爱的美味佳肴，同时，还可作为生物反应器应用于多糖、酶等物质的生产，具有广阔的应用前景。目前，双孢蘑菇品种改良是通过自然变异菌株筛选、杂交育种等传统的方法进行，但因双孢蘑菇同宗结合、强制自交的遗传特性，采用传统育种方法工作量巨大、育种进程缓慢且性状改良程度有限。随着现代分子生物学技术的发展，双孢蘑菇基因组测序的完成，通过转基因技术可以克服上述传统育种的局限性，为双孢蘑菇高效育种开辟一条新的途径。启动子是调控基因表达的重要顺式作用元件，是位于结构基因5’端上游的DNA序列。根据启动子驱动目的基因表达时间和部位的不同，可将启动子分为组成型启动子，组织特异性启动子和诱导型启动子。目前转基因技术常利用组成型启动子来启动外源基因表达，外源基因持续、高效的表达可产生大量异源蛋白和代谢产物，导致菌体生长不良甚至死亡，也不利于转基因菌株生物量的积累。诱导型启动子相对于组成型启动子的优势在于，它启动活性很低，甚至无启动活性，但在特定的外界信号的刺激下，可以快速启动目的基因大量表达，当外界诱导解除时，基因表达停止。在转基因技术中使用诱导型启动子，能很好地解决组成型启动子调控基因高强度表达造成的转化障碍，在保证菌株良好生长的同时，可以根据需要在特定的发育阶段或生长环境下，快速诱导外源基因的表达。为此，本专利技术开发了一种新的双孢蘑菇诱导型启动子，在水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）诱导下，可启动外源基因在转基因双孢蘑菇中表达。该启动子可代替组成型启动子，为双孢蘑菇转基因技术提供有效的技术手段，在基因工程改造中具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种双孢蘑菇诱导型启动子和表达载体及其应用。解决该技术问题采用如下技术方案：本双孢蘑菇诱导型启动子的核苷酸序列是：(1)序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或(2)与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；或(3)在SEQIDNO.1所示的核苷酸序列基础上进行取代、缺失或添加得到的、具有驱动和/或调节表达功能的核苷酸序列。本重组表达载体含有前述双孢蘑菇诱导型启动子，该启动子连接于所述表达载体GUS基因的上游。本诱导型启动子在调控双孢蘑菇基因表达方面的应用，将前述重组表达载体导入双孢蘑菇中，在SA、ABA诱导培养下，该重组表达载体中启动子被激活，调控GUS基因在双孢蘑菇中的表达。本专利技术的有益效果是，分离和鉴定了一种新的双孢蘑菇诱导型启动子，并提供了一种在SA、ABA诱导处理下启动基因表达的方法。该诱导型启动子不仅可以代替组成型启动子，应用于双孢蘑菇转基因工程中，而且，可将该诱导型启动子连接到任何目的基因的上游，实现基因在双孢蘑菇中的调控表达，在双孢蘑菇品质的遗传改良和发酵代谢产物调控等实际应用中具有显著价值。附图说明图1为双孢蘑菇重组载体pCghG-pAb3的T-DNA图谱。图2为转基因蘑菇的PCR检测电泳图。图3为转基因菌株GUS组织染色图。具体实施方式本专利技术下面结合实施例并参照附图作进一步详述。本专利技术的目的是提供一种双孢蘑菇诱导型启动子，获得具有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。在第一方面，本专利技术提供一种双孢蘑菇诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或者与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；或者在SEQIDNO.1所示核苷酸序列的基础上进行碱基取代、缺失或添加得到的、具有驱动和/或调节表达功能的核苷酸序列。现将本专利技术所述启动子命名为pAb3。在第二方面，本专利技术还提供了启动子pAb3的重组表达载体。在所述重组表达载体中，所述启动子pAb3连接于待表达基因的上游；优选地，所述的待表达基因为GUS基因；将所述的重组表达载体命名为pCghG-pAb3。在第三方面，本专利技术提供一种宿主菌。所述宿主菌包括本专利技术第一方面所述启动子pAb3，或第二方面所述重组载体pCghG-pAb3；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。在第四方面，本专利技术提供一种诱导型启动子在双孢蘑菇中的应用，具体包括如下步骤：（1）构建本专利技术第二方面的重组表达载体；（2）将步骤(1)构建的重组表达载体导入双孢蘑菇；（3）获得转基因双孢蘑菇；（4）在SA、ABA诱导处理后，实现了本专利技术第一方面所述启动子驱动目的基因诱导表达。上述应用中，所述目的基因为GUS基因。上述应用中，所述转基因双孢蘑菇包括转基因菌株或其后代的原生质体、菌丝体、子实体、孢子等。本专利技术将一些相关实验的情况介绍如下：（1）双孢蘑菇启动子pAb3的分离和鉴定采用SDS方法提取双孢蘑菇‘As2796’基因组DNA，具体步骤如下：取0.1g菌丝体，液氮研磨成粉末，加入DNA提取液(2%SDS，0.5MNaCl，50mMTris-HCl，50mMEDTA，pH8.0，1%β-巯基乙醇)700μl，转入1.5mL离心管中，65℃保温50min；12000rpm，4℃离心15min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀，12000rpm离心15min；取上清，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)混匀，12000rpm离心15min；取上清液至一新离心管，加入1/10体积NaAc（pH5.2）和2倍体积无水乙醇（冰冷），沉淀DNA，离心去上清，70%乙醇洗沉淀，干燥后溶解于100μlTE中，进行电泳及紫外分光光度计检测；设计特异引物AbP3-F和AbP3-R，以双孢蘑菇基因组DNA为模板，用高保真酶PrimeSTARMaxDNAPolymerase进行PCR扩增。引物序列：AbP3-F：CAATGTCGACCCACTGTTTGAAACGGAAACTGTCAbP3-R：GAACCATGGCTTTAGAGGAGGGCTTGGAATCTGAG引物AbP3-F（序列如SEQIDNO.2所示）中序列GTCGAC为SalⅠ酶切位点，引物AbP3-R（序列如SEQIDNO.3所示）中序列CCATGGC为NcoⅠ酶切位点。上述PCR扩增体系如下：PrimeSTARMaxbuffer25ulAbP3-F（10mM）1μlAbP3-R（10mM）1μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双孢蘑菇诱导型启动子，其特征在于所述启动子的核苷酸序列是：(1)序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或(2)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(3)在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列基础上进行取代、缺失或添加得到的、具有驱动和/或调节表达功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种双孢蘑菇诱导型启动子，其特征在于所述启动子的核苷酸序列是：
(1)序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列或
(2)与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或
(3)在SEQIDNO.1所示的核苷酸序列基础上进行取代、缺失或添加得到的、具有驱动
和/或调节表达功能的核苷酸序列。
2.一种重组表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：李南羿，许晓丹，冉欣欣，高雅，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33