植物镉诱导表达启动子CdS1及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种植物镉诱导表达启动子CdS1及其应用，所述植物镉诱导表达启动子CdS1能够驱动目的基因在镉诱导条件下表达。更具体而言，本发明专利技术的启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列或其同源物、衍生物。在应用中，本发明专利技术的启动子可以与具有改善植物的耐镉或抗镉性状的基因结合使用，将本发明专利技术的启动子与耐镉或抗镉基因相连接导入植物中，并驱动耐镉或抗镉基因在植物的根、茎、叶或其他部位表达，可以提高植物的耐镉或抗镉性能。比如，如果将本发明专利技术的启动子与抑制植物镉吸收的基因相连接，诱导该基因在高镉环境下集中表达，可以减少植物对镉的吸收，进而降低食品中的镉含量。因此，从环境安全和食品安全两个角度来讲，本发明专利技术的启动子都具有极高的商业价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
具体而言，本专利技术涉及一种植物 镉诱导表达启动子及其应用，该启动子能够对重金属镉进行强烈响应进而在植物转基因调 控体系中驱动目标基因在植株中表达。
技术介绍
镉（Cd)是动植物生长发育的非必需元素，且具有很强的毒性。与其它重金属元 素相比，它在环境中活性较强，因此在绿色植物中富集系数较大，往往在不影响植物正常生 长的情况下，植物可积累较高浓度的镉（Cd)，然后通过食物链进入人体，引起健康问题。镉 (Cd)在人体中可存留几年，乃至数十年，长期食用高镉（Cd)浓度的植物食品，将导致慢性 中毒。镉（Cd)在人体中主要蓄积于肾和肝脏中，当超过一定含量时会引起骨痛病，肾损伤， 甚至致癌、致畸等（Gunilla，2002)。如20世纪60年代日本发现的"骨痛病"，就是由镉污 染而引发的公害病。 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，恰被认为是镉（Cd)吸收最强的大宗谷类 作物（Chancyetal.，2004)。当镉（Cd)浓度高到一定含量时，水稻会出现受害的症状，表现 为植株矮小，茎生长缓慢，叶片变窄、失绿、卷曲，叶片干重、鲜重降低，根系干重、鲜重降低 等，严重受害时，根系少而短，呈褐色，根毛发育不良（廖自基，1992);在生理生化方面，多 表现为叶绿素含量下降，光合作用、蒸腾作用和RuBP羧化酶活性等受到抑制，引起氧化胁 迫、膜以及DNA损伤等。然而，水稻对锦（Cd)的积累，品种间存在着明显差异（Zhang等；2000)，不管是根 膜、根部还是地上部分，镉（Cd)积累均存在着显著差异（李花粉等，1998 ;刘敏超等，2001)。 其中以根富集镉（Cd)的能力最强，一般以根〉茎叶〉籽粒的顺序递减。水稻各器官重金属 元素的分布也因不同生育时期而异。衣纯真等（1996)研宄表明，水稻开花期地上部吸收的 镉（Cd)，有74.9%分布在叶中，25. 1%分布在茎中；到成熟期，叶占51.9%，茎中占37.3%， 谷壳占3. 4%，糙米占6. 9%。植物抗镉（Cd)机制主要包括镉的解毒和转运两个方面（Heiss等，1999 ;Heiss 等，2003)，涉及植物的硫代谢、氧化胁迫防卫和对镉的束缚、隔离及外排等过程。目前水稻 中已克隆一些耐镉（Cd)基因，如0sHMA2、0sHMA3、0sHMA9、0sNRAMPl、0sIRTl等。过表达或 干扰这些基因能改变水稻的耐Cd性。早期的转基因研宄中，常利用组成型强表达启动子驱 动这些基因，以提高某一个或几个功能基因的表达水平，进而实现目标性状的改良。这种外 源基因的持续高强度表达，可能会破坏相关的代谢平衡，并造成一些不必要的能量浪费，严 重时会影响作物生长发育。且加大了潜在的环境和食品安全性风险。相反，诱导型启动子 则可以驱动目标基因，在合适的时间和空间上，以合适的水平表达，能够减免上述风险。因 此，对诱导型启动子的发现和研宄，将有助于转基因技术的进步。而目前现有技术中对诱导 型启动子，尤其是能够对重金属进行响应的诱导型启动子的研宄明显不足。目前所发现的 对重金属进行响应的启动子寥寥无几。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种驱动外源基因在植物中诱导表达的启动子、获得含有该 启动子序列的重组载体以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子叶植 物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。 为了实现上述目的，一方面，本专利技术提供一种植物镉诱导表达启动子，其特征在 于，所述植物镉诱导表达启动子能够驱动目的基因在镉诱导条件下表达。 进一步地，所述植物镉诱导表达启动子的DNA序列与SEQ ID No:l所示的DNA序 列有至少80 %同源性； 或者，所述植物镉诱导表达启动子为在SEQ ID No: 1所示的DNA序列中添加、取 代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或衍生物； 或者，所述植物镉诱导表达启动子具有与SEQ ID No: 1所示的DNA序列杂交的产 物。这些植物镉诱导表达启动子序列与SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有类似功能，即驱 动目标基因在植物中表达。 进一步地，所述植物镉诱导表达启动子的DNA序列与SEQ ID No:l所示的DNA序 列有至少90 %的同源性。 进一步地，所述植物诱导表达启动子由SEQ ID No: 1所示的DNA序列构成。 另一方面，本专利技术提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含所述的植物镉诱 导表达启动子。 另一方面，本专利技术提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含所 述的植物镉诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物镉诱导表达启动子连接于 载体中待表达的基因序列的上游。 进一步地，所述待表达的基因为Gus基因，或者提高植物耐重金属性能的基因。优 选地，为耐镉或抗镉相关基因。 另一方面，本专利技术提供一种转化子，其特征在于，所述转化子包含所述的植物镉诱 导表达启动子、所述的表达盒、或所述的重组表达载体。其中，所述转化子优选为转基因细 胞系、愈伤组织或植株。 另一方面，本专利技术提供一种所述的植物镉诱导表达启动子在培育转基因植物中的 应用，其特征在于，所述应用包括：将所述植物镉诱导表达启动子连接于载体中待表达的基 因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中 进行培育。 进一步地，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、 玉米、大麦、高粱或燕麦。 本专利技术序列表中SEQ ID No:l所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的镉诱导表达启动子，本文中称为CdSl或启动子CdSl。 所述重组表达载体为将SEQ ID No: 1所示的序列即CdSl或启动子CdSl构建于 PCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-CdSl。 本专利技术中所提供的启动子的DNA序列为序列表中SEQ ID No :1，需要说明的是：序 列表中SEQ ID No :1中，序列开头部分的"ATGCCCCAGTGATTTCTACGAT"为获得启动子过程中 使用的正向引物的留存序列，共计22bp ;序列末尾部分的"AAACAGCAAGACACAATACACA"为获 得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补）， 共计22bp ;该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是， 本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的 DNA序列。 综上所述，本专利技术的专利技术人利用SEQ ID No:2所示的正向引物以及SEQ ID No:3 所示反向引物从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆Cd S1基因上 游包括转录起始位点在内的1739bp的DNA序列。通过将该启动子转入水稻愈伤组织中，获 得相应的转基因水稻植株。对转基因水稻进行镉胁迫处理，检测处理前后转基因植株中各 组织的Gus基因表达定量发现，与未处理的各部位相比，镉处理后各部位上的Gus基因表达 水平明显提高，从而证明该1739bp的序列在镉诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物镉诱导表达启动子，其特征在于，所述植物镉诱导表达启动子能够驱动目的基因在镉诱导条件下表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏鹏程，杨剑波，邱春红，秦瑞英，李浩，杨亚春，李莉，马卉，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34