一种T细胞高活性的启动子及其用途制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种T细胞高活性的启动子及其用途。具体地，所述T细胞高活性的启动子包含元件1和元件2，其中，所述元件1为EF1α启动子和/或含内含子的EF1α启动子；所述元件2为选自mCMV增强子、hCMV增强子和CD3e增强子中的任意一个、两个或者三个。本发明专利技术的启动子能在T细胞内高效表达外源基因，且序列稳定，不会在原核细胞及真核细胞转移过程中发生序列丢失。该启动子可适用于在过继细胞免疫治疗过程中，驱动包括外源基因特别是全长抗体基因在T细胞内的高效表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种启动子，具体地，涉及一种人工合成的嵌合 启动子，该启动子在T细胞中具有高活性。本专利技术还涉及含有该启动子的重组载体、重组病 毒、以及所述启动子控制外源基因在转基因T细胞治疗中的用途。
技术介绍
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。2011年， Nature及临床肿瘤最顶级杂志JC0分别发表相同题目"肿瘤免疫治疗的时代已经来临"的 评论文章（Nature. 2011 ;480 (7378) :480;JClinOncol. 2011 ;29 (36) :4828)，认为肿瘤免 疫细胞治疗即将迎来新一轮的研宄高潮，未来有可能在肿瘤治疗中占据相当重要的地位。 而在产业化领域，2013年8月美国高盛报告，八大可能改变世界的领域创新，癌症免疫疗法 排名第二，其预计到2025年有100-150亿美元的市场只是个开始。目前该疗法仍被用于晚 期肿瘤患者治疗，但它将来可能像化疗一样，成为癌症治疗的一线方法。最近，花旗银行分 析师认为未来10年60%的晚期癌症病人将用免疫治疗，在美国达350亿美元。目前，免疫治疗两大热点分别是：1.免疫检查点单抗治疗，包括CTLA-4单抗与 H)-l单抗；2.转基因CAR-T细胞治疗（经嵌合抗原受体基因修饰后的T细胞）或转基因 TCR-T细胞治疗（经T细胞受体基因修饰的T细胞）。围绕这两个热点的商业并购与投资案 例频频上演。因而，如能通过转基因修饰的手段，利用T细胞表达具有功能活性的单抗（例 如，免疫检查点单抗），则能协同发挥抗肿瘤细胞免疫（主要由杀伤性T细胞介导）与体液 免疫（主要由抗体介导）的双重效应，发挥更好的抗肿瘤效果。为达到该目的，构建一个合 适的全长抗体表达系统非常关键。 启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5'端上游，是RNA聚合酶识别、 结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶（holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动 子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的 关键。 根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育 阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。 哺乳动物中常用的组成型启动子包括病毒来源：鼠或人巨细胞病毒（CMV)启动子 (分别简称mCMV与hCMV)、猴空泡病毒SV40启动子；人基因组天然来源：EFla启动子、泛素 启动子（Ubiquitin，简称Ubi)、0 -actin启动子、PGK-1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动 子、GAPDH启动子、eIF4Al启动子、Egrl启动子、FerH启动子、SM22a启动子、Endothelin-1 启动子等。 哺乳动物常用组织特异性启动子包括：B29启动子（B细胞特异性）、⑶14启动子 (单个核细胞特异性）、CD43启动子（淋巴细胞及血小板特异性）、CD45及INF-0启动子 (造血细胞特异性）、⑶68启动子（巨噬细胞特异性）、Desmin及Myoglobin启动子（肌肉 细胞特异性）、CD105及CD102启动子（内皮细胞特异性）、GFAP启动子（星形胶质细胞特 异性）、GPIIb启动子（巨核细胞特异性）、SurfactantProteinB启动子（肺特异性）、NSE 启动子（成熟神经元细胞特异性）、Alb启动子（肝特异性）等。 常用肿瘤特异性启动子包括:AFP启动子（肝癌特异性）、CCKAR启动子（胰腺癌特 异性）、PSA启动子（前列腺癌特异性）、Tyr启动子（黑色素瘤特异性）、hTERT启动子/CEA 启动子/Survivin启动子 /CXCR4 启动子 /C0X_2/L-plastin启动子/epididymisprotein 4启动子/E2F1启动子（肿瘤广谱特异性）等。 常用诱导型启动子包括：基于四环素（Tet)系统的诱导型启动子（包括Tet-On或 Tet-off)、脱皮激素类诱导系统的诱导型启动子、FK506调控系统的诱导型启动子、纳巴霉 素诱导系统的诱导型启动子、RU486诱导系统的诱导型启动子等。 尽管在之前的研宄中，我们已经建立腺病毒介导的全长抗体基因表达系统，并初 步实现了在T细胞中表达具有功能活性的全长抗体，但由于缺乏合适的启动子，抗体表达 量难以达到治疗浓度。因而，为实现在T细胞内高效表达外源基因特别是全长抗体基因，急 需设计并构建新的T细胞内高活性启动子。
技术实现思路
本专利技术人经过大量的试验和创造性的劳动，设计构建了一系列新型嵌合启动子， 并从中筛选获得一组能在T细胞内高效表达的启动子。本专利技术人惊奇地发现，与其它并行 构建的嵌合启动子不同，本专利技术启动子序列稳定，不会随着其在原核细胞或真核细胞内的 转移而发生序列丢失现象。该启动子特别适用于驱动外源基因（如全长抗体基因）在T细 胞内的高效表达。由此提供了下述专利技术： 本专利技术的一个方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含元件1和元件2，其中， 所述元件1为EF1a启动子和/或含内含子的EF1a启动子； 所述元件2为选自mCMV增强子、hCMV增强子和⑶3e增强子中的任意一个、两个 或者三个。 具体地，所述多核苷酸为启动子；更具体地，为嵌合启动子。 在本专利技术的一个实施方案中，所述多核苷酸由所述元件1和所述元件2组成。 在本专利技术的一个实施方案中，所述元件1为单拷贝或者多拷贝，和/或所述元件2 为单拷贝或者多拷贝。 在本专利技术的一个实施方案中，所述元件2中所选的mCMV增强子、hCMV增强子或 ⑶3e增强子独立地为单拷贝或者多拷贝。 不拘于理论的限制，mCMV增强子与hCMV增强子来源于不同种属的同一类型病毒 基因组（分别是鼠巨细胞病毒属，以及人巨细胞病毒属），功能相近，相应的DNA序列同源 性较高。因而，既往研宄通常将其作为功能替代的顺式作用元件而单独使用，即便有将它 们联合使用的考虑，鉴于两者序列相似度高，也存在序列不稳定容易丢失的风险。一个重 要原因是，无论是原核表达载体还是真核表达载体，其在宿主内复制，就涉及DNA聚合酶 的参与，而DNA聚合酶在对重复序列的复制过程中由于模板的复杂性，有可能会将某些重 复单元漏过，导致序列的丢失。这在基因操作领域属于一种共识。相应的文献可以参考PCR过程中DNA聚合酶的对重复序列模板扩增时存在的错配现象。Biasandartifacts inmultitemplatepolymerasechainreactions(PCR).JBiosciBioeng. 2003 ； 96(4) : 317-23。 根据上面任一项所述的多核苷酸，其中，所述元件2位于所述元件1的上游（5' 端）。 根据上面任一项所述的多核苷酸，其依次包含： (l)mCMV增强子+hCMV增强子+EFla启动子， (2)CD3e增强子+EFla启动子， (3)CD3e增强子+mCMV增强子+hCMV增强子+EF1a启动子， (4)mCMV增强子+hCMV增强子+含内含子的EF1a启动子， (5)⑶3e增强子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其包含元件1和元件2，其中，所述元件1为EF1α启动子和/或含内含子的EF1α启动子；所述元件2为选自mCMV增强子、hCMV增强子和CD3e增强子中的任意一个、两个或者三个；具体地，所述多核苷酸为启动子；更具体地，所述多核苷酸为嵌合启动子；在本专利技术的一个实施方案中，所述多核苷酸由所述元件1和所述元件2组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，金华君，吕赛群，刘品一，李振海，李林芳，黎江，吴红平，吴孟超，
申请(专利权)人：上海细胞治疗研究院，中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院，上海细胞治疗工程技术研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31