一种微小RNA启动子活性检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种微小RNA启动子活性检测的方法，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤：利用分子生物学技术，在无启动子、增强子的真核载体基础上，构建含miRNAs启动子、miRNA和3’段侧翼序列在内的重组真核载体；将重组真核载体体外转染真核细胞，利用荧光定量PCR仪检测miRNAs成熟体的表达；通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应。本发明专利技术提供的微小RNA启动子活性检测的方法可以在不依赖昂贵仪器的条件下，广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中检测miRNAs启动子活性，方便地观察miRNAs表达后的生物学效应，检测方便并准确反映启动子活性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种微小RNA启动子活性检测的方法，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤：利用分子生物学技术，在无启动子、增强子的真核载体基础上，构建含miRNAs启动子、miRNA和3’段侧翼序列在内的重组真核载体；将重组真核载体体外转染真核细胞，利用荧光定量PCR仪检测miRNAs成熟体的表达；通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应。本专利技术提供的微小RNA启动子活性检测的方法可以在不依赖昂贵仪器的条件下，广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中检测miRNAs启动子活性，方便地观察miRNAs表达后的生物学效应，检测方便并准确反映启动子活性。【专利说明】—种微小RNA启动子活性检测的方法
本专利技术属于基因启动子活性检测领域，尤其涉及一种微小RNA启动子活性检测的方法。
技术介绍
目前，公知的微小RNA启动子活性检测方法是利用分子生物学手段，将微小RNA启动子构建到pGL3-Basic载体上,重组载体转染真核细胞后，利用Luminometer突光素酶检测仪检测荧光素酶活性来判断miRNA启动子活性。但是，该方法不仅需要依赖昂贵的专业检测仪器Luminometer荧光素酶检测仪，且无法直接观察该启动子是否可以启动miRNAs的表达及其后续的生物学效应，给广大科研工作者带来了极大的不便。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种微小RNA启动子活性检测的方法，旨在解决目前微小RNA启动子活性检测方法需要依赖昂贵的专业检测仪器Luminometer荧光素酶检测仪，且无法直接观察该启动子是否可以启动miRNAs的表达及其后续的生物学效应的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种微小RNA启动子活性检测的方法，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤:步骤一、首先通过GeneBank获得miRNA前段5’端-1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据无启动子、增强子的真核载体pGL3.0-Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物上游和下游分别引入酶切位点XhoI和BgIII ;接下来抽取人肺癌％D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物扩增目的片度，常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的真核载体进行连接；30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；挑选单个阳性克隆，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR、酶切和测序鉴定；步骤二、将构建成功的重组真核载体抽提，鉴定纯度和浓度后，-80C保存；常规培养人肺癌％D细胞，按5X IO4个细胞铺于24孔板中，将IOug重组载体和对照载体体外分别利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞后，继续在5% C02，37°C条件下培养，48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Realtime PCR探针法检测miRNA表达水平；步骤三、通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应；利用MTT实验检测各转染组中％D细胞生长的变化。进一步,步骤一中真核载体是pGL3.0-Basic。进一步，步骤二中miRNA 是 miR_7。进一步,步骤二中重组真核载体是pGL3.0-Basic-miR-7-promoter。本专利技术提供的的微小RNA启动子活性检测的方法可以在不依赖昂贵仪器的条件下，广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中检测miRNAs启动子活性，方便地观察miRNAs表达后的生物学效应，检测方便并准确反映启动子活性。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术实施例提供的微小RNA启动子活性检测的方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的表达载体构建的设计原理图；图中:MCS、多克隆位点(Multiple clone sites) ;pA、多聚腺苷酸化信号(Polyadenylation signal) ;0r1、复制起始位点(origin ofreplication) ;Ampr、氨节西林抗性(AmpICillin resistance) !Promoter、启动子；Luc+、突光素酶基因(Luciferasegene) ;SV40、猴空泡病毒40 (Simian virus40) ；fi or1、fl卩遼菌体复制起始位点(Flphageorigin ofreplication)；图3是本专利技术实施例提供的以miRNA家族成员miR_7和载体pGL3.0-Basic为例的表达载体构建示意图；图中:MCS、多克隆位点(Multiple clone sites) ;pA、多聚腺苷酸化信号(Polyadenylation signal) ;0r1、复制起始位点(origin ofreplication) ;Ampr、氨节西林抗性(AmpICillin resistance) !Promoter、启动子；Luc+、突光素酶基因(Luciferasegene) ;SV40、猴空泡病毒40 (Simian virus40) ；fi or1、fl卩遼菌体复制起始位点(Flphageorigin of replication)；图4是本专利技术实施例提供的表达载体构建过程中的PCR、酶切和测序结果；图中:A、启动子PCR扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳；B、克隆菌液PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳；C、重组质粒双酶切；D、重组质粒测序；图5是本专利技术实施例提供的表达载体转染细胞后miR-7表达水平检测示意图；图6是本专利技术实施例提供的重组载体转染细胞后miR-7生物学效应检测示意图；图中:A、光镜；B、MTT实验。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。图1示出了本专利技术提供的微小RNA启动子活性检测的方法的流程，为了便于说明，仅仅示出了与本专利技术相关的部分。下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步阐述。本专利技术提供的【具体实施方式】如下: 1.以miRNAs家族成员miR_7和载体pGL3.0-Basic为例，首先通过GeneBank获得miR-7前段5’端-1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据pGL3.0-Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物(上游和下游)分别引入酶切位点(XhoI 和 BgIII);引物序列:h游，5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’:下游引物(引A BgIII 位点):5’ GAAGATCTTCGA—GTCTGCCGATGGGTGT-3?。预期产物大小，1302bp。2.抽取人肺癌％D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物成功扩增目的片度(图4A)；3.常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的PGL3.0-Basic进行连接；4.30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；5.挑选单个阳性克隆，共6个，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR鉴定，结果显本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微小RNA启动子活性检测的方法，其特征在于，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤：步骤一、首先通过GeneBank获得miRNA前段5’端?1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据无启动子、增强子的真核载体pGL3.0?Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物上游和下游分别引入酶切位点XhoI和BgIII；接下来抽取人肺癌95D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物扩增目的片度，常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的真核载体进行连接；30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；挑选单个阳性克隆，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR、酶切和测序鉴定；步骤二、将构建成功的重组真核载体抽提，鉴定纯度和浓度后，?80℃保存；常规培养人肺癌95D细胞，按5×104个细胞铺于24孔板中，将10ug重组载体和对照载体体外分别利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞后，继续在5％CO2，37℃条件下培养，48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Realtime?PCR探针法检测miRNA表达水平；步骤三、通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应；利用MTT实验检测各转染组中95D细胞生长的变化。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，周涯，廖珍媛，李永菊，罗军敏，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：