本公开涉及使用多磷酸分解试剂三磷酸酯、多磷酸酯、亚氨基二磷酸酯、硫代二磷酸酯(或者单硫代焦磷酸酯)和相关的化合物中的至少一种、通过多磷酸分解(APP)反应进行活化的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本公开涉及使用多磷酸分解试剂三磷酸酯、多磷酸酯、亚氨基二磷酸酯、硫代二磷酸酯(或者单硫代焦磷酸酯)和相关的化合物中的至少一种、通过多磷酸分解(APP)反应进行活化的方法。【专利说明】利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化聚合核酸相关申请的交叉引用本申请要求在35U.S.C.§ 119(e)下，美国临时专利申请号61/422,477(其于2010年12月13日提交，并以其整体通过参考的方式并入本文)的优先权权益。
本公开涉及利用在存在改进的多磷酸化试剂的情况下，通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化，进行核酸的聚合方法。
技术介绍
本公开涉及核酸(或者核苷酸)的聚合方法，利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化。聚合作用可以使用具有3’ -末端以双脱氧核苷酸封闭的引物，在含有焦磷酸酯(PPi)和dNTP平衡的反应混合物中实现。这些方法已经先前在，例如，美国专利号6，534，269B2, 7，033，763B2, 7，238，480，7，105，298，7，504，221 和 7，919，253 中描述过。相似的方法也在USPN7，745，125中描述。这些方法也有许多应用，包括存在野生型等位基因时罕见等位基因的检测(例如，在存在IO6-1O9野生型等位基因时的一种突变的等位基因)。所述方法对于以下时有用的，例如，检测微小残留病致病剂(例如，在缓解期间罕见的剩余癌细胞，尤其是P53基因或其它先前确定肿瘤内的抑癌基因的突变)，和/或测量突变负荷(例如，出现在正常组织中特定的体细胞突变的频率，如血液或尿液)。这些方法的其他应用对本【技术领域】的技术人员是已知的。那些在本
的技术人员的期望进行这种方法的改进方法。已经令人惊讶地发现，其他一些化合物也能够解封闭核酸。本文所述的方法使用各种多磷酸分解试剂(polyphosphorolyzing agent)执行APP反应。从这种改进的方法的下面描述中，这些方法的优点将是显而易见的。`【专利附图】【附图说明】图1.使用三磷酸酯-催化的APP滴定人类DNA。图2.比较三磷酸酯-催化的APP与基于SYBR Green I的检测。图3A，3B和3C.通过Power SYBR从质粒进行的扩增例子。图4A，4B,和4C.从质粒DNA进行三磷酸酯_催化的APP扩增的例子。图5.使用PA-10，比较三磷酸酯-和PP1-催化的反应。图6A，6B, 6C, 6D, 6E和6F.三磷酸酯-和PP1-催化的反应示例性的扩增曲线和解离曲线。图7.以125pg人类DNA输入进行的PP1-催化的反应的解离曲线。图8.使用PA-17，比较三磷酸酯-和PP1-催化的反应。图9.A.线性扩增的动力图谱。B.使用完美匹配底物和错配底物的三种反应的线性扩增的相对率。图10.在存在多种浓度的TP情况下,通过Therminator III的线性延伸。图11.通过RQY，使用Mn++作为辅助因子，ddC_封闭的引物的解封闭和延伸。图12.四磷酸酯-引发的PCR。图13.1DP-引发的 PCR。图14.在常规PCR (填充的)中和在APP PCR (开放)中，具有4_(菱形)、6_(方形)、或者9-(三角形)碱基重叠的引物之间的扩增曲线。图15.在常规PCR (填充的)中和在APP PCR (开放)中，48引物单独的扩增曲线。图16.使用APP的数字RCR。图17.使用传统基于染料的master mix的数字RCR。图18.在使用APP和使用传统基于染料master mix的数字PCR中，阴性反应和阳性反应的Ct分布。
技术实现思路
本文描述的是利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化，从测试样品扩增靶核酸的方法。在某些实施方案中，APP使用一种或多种多磷酸分解试剂(polyphosphorolyzingagent)实现。在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以通过公示I代表:【权利要求】1.一种从包含可以通过多磷酸分解作用除去的不可延长的3’末端的封闭的寡核苷酸制备未封闭的寡核苷酸的方法，所述方法包括使与靶核酸杂交的寡核苷酸接触选自以下的一种或多种多磷酸分解试剂: 通式I的化合物: 2.权利要求1所述的方法，进一步包括延长所述未封闭的寡核甘酸以制备所期望的核酸链。3.权利要求2所述的方法，进一步包括扩增所述所期望的核酸链。4.权利要求1任意一项所述的方法，其中所述酶是DNA聚合酶。5.权利要求4所述的方法，其中所述酶是热稳定的DNA聚合酶。6.权利要求5所述的方法,其中所述热稳定的DNA聚合酶选自:热稳定的Til、Taq、AMPLITAQFS,THERMOSEQUENASE,RQKRQY,THERMNATOR 1.THERMINATOR I1.THERMINATOR III和 THERMINATOR GAMMA7.权利要求3所述的方法，其中所述延长和扩增步骤使用聚合酶链式反应实现。8.权利要求2所述的方法，为了聚合靶核酸，所述方法包括使用一种或多种公式I所述的多磷酸分解试剂、通过多磷酸分解作用(APP)反应、利用活化进行聚合: 9.权利要求2所述的方法，为了聚合靶核酸，所述方法包括使用一种或多种公式II所述的多磷酸分解试剂、通过多磷酸分解作用(APP)反应、利用活化进行聚合: 10.权利要求2所述的方法，为了聚合靶核酸，所述方法包括使用一种或多种选自以下的多磷酸分解试剂、通过多磷酸分解作用(APP)反应、利用活化进行聚合: 11.权利要求8所述的方法，进一步包括扩增因此聚合的核酸分子。12.权利要求11所述的方法，其中所述酶是DNA聚合酶。13.权利要求12所述的方法，其中所述酶是热稳定的DNA聚合酶。14.权利要求13所述的方法,其中所述热稳定的DNA聚合酶选自:热稳定的Tfl、Taq、A PLITAQFS、THERMOSEQUENASE、RQ1、RQY、THERM INATOR 1、THERMINATOR I1、THERMINATORIII 和 THERMINATOR GAMMA。15.权利要求11所述的方法，其中所述延长和扩增步骤使用聚合酶链式反应实现。16.权利要求2所述的方法，为了聚合靶核酸，包括使用一种或多种多磷酸分解试剂、通过多磷酸分解作用(APP)反应、利用活化进行聚合。17.权利要求16所述的方法，进一步包括扩增因此聚合的核酸分子。18.权利要求17所述的方法，其中所述酶是DNA聚合酶。19.权利要求17所述的方法，其中所述酶是热稳定的DNA聚合酶。20.权利要求19所述的方法,其中所述热稳定的DNA聚合酶选自:热稳定的Tfl、Taq、AMPLITAQFS、THERMOSEQUENASE、RQl、RQY、THERM INATOR 1、THERMINATOR I1、THERM INATORIII 和 THERMINATOR GAMMA。21.权利要求20所述的方法，其中所述延长和扩增步骤使用聚合酶链式反应实现。22.权利要求3所述的方法，其中所述反应包括步骤: (a)使核酸与具有不可延长的3’末端的第一寡核苷酸P*退火，其中所述第一寡核苷酸P*的所述3’不可延长的末尾可以通过多磷酸分解作用除去； (b)通过多磷酸分解作用除本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：拉里·L·习，P·肯尼，Z·马，D·普罗森，S·亨德里克斯，R·内格尔，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：
国别省市：
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