用于测量胃肠癌中的生物标记物的方法技术

本发明专利技术针对用于确定启动子活性的方法。本发明专利技术还描述了一种用于确定受试者的癌症易感性的方法以及用于检测受试者的癌症的生物标记物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分子生物学领域。确切地说，本专利技术涉及用于确定启动子活性的方法。专利技术背景胃癌(GC)是导致全球癌症死亡的一个主要原因。大多数的GC是腺癌，并且近期进行的外显子组和全基因组研究披露了新的GC驱动基因和突变标志。除编码蛋白质的基因外，非编码基因组区域中的调控元件也可能造成恶变，因为这些元件会深刻地影响染色质结构和基因表达。很少有研究在基因组层面上探索在胃癌发生期间体细胞改变的调控元件谱系。包括启动子和增强子在内的调控元件可以被鉴别为展现组蛋白修饰(“染色质标记物”)的区域。截至目前，针对癌症进行的大部分染色质标记物研究使用了永生化细胞系，因为现有的方案需要大量的生物材料。然而，在体外培养的癌症细胞系会展示与原发肿瘤截然不同的表观遗传模式，并且细胞系还可能经历体外适应，从而因广泛传代而获得遗传和表观遗传变化。也难以鉴别使用癌症细胞系的体细胞获得性改变，因为这些细胞系通常缺乏相配的正常对应物。因此，需要提供一种测量染色质标记物的方法，该方法克服了或至少改进了以上描述的一个或多个缺点。
技术实现思路
在一方面，提供了一种确定至少一个启动子在癌症生物样品中相对于在非癌症生物样品中的活性的方法，所述方法包括：针对从所述非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述癌症生物样品获得的包含至少一个启动子序列的分离的核酸进行映射(mapping)，以获得所述至少一个启动子的读段数/千碱基/百万(read per kilo-base per million，RPKM)的值或片段数/千碱基/百万(fragments per kilo-base per million，FPKM)的值；及使用所述RPKM或FPKM值确定所述核酸中所述至少一个启动子序列相对于所述参比核酸序列中所述至少一个启动子的活性的差异活性。根据另一方面，提供了一种用于确定受试者的癌症易感性的方法，所述方法包括：针对从非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述受试者的癌症生物样品获得的包含至少一个启动子的分离的核酸进行映射，以获得所述至少一个启动子的RPKM或FPKM值；及使用所述RPKM或FPKM值确定所述核酸中所述至少一个启动子相对于所述参比核酸序列中所述至少一个启动子的活性的差异活性，其中相对于所述非癌症样品中所述至少一个启动子的活性，所述癌症样品中所述至少一个启动子的增加的活性指示所述受试者对癌症具有易感性。在另一方面，提供了一种用于确定受试者体内与癌症相关的至少一个启动子的存在的方法，所述方法包括：针对从非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述受试者的癌症生物样品获得的包含至少一个启动子的分离的核酸进行映射，以获得所述至少一个启动子的RPKM或FPKM值；及使用所述RPKM或FPKM值确定所述核酸中所述至少一个启动子相对于所述参比核酸中所述至少一个启动子的活性的差异活性，其中相对于所述非癌症样品中所述至少一个启动子的活性，从所述受试者获得的癌症生物样品中所述至少一个启动子的增加的活性指示受试者体内存在与癌症相关的启动子。在另一方面，提供了一种用于检测受试者的癌症的生物标记物，所述生物标记物包含在癌症生物样品中相对于在正常非癌症生物样品中具有增加的活性的至少一个启动子，其中相对于总启动子群，所述启动子包含增加的SUZ12结合位点。在另一方面，提供了一种用于确定与癌症相关的至少一个启动子在癌症生物样品中相对于在非癌症生物样品中的存在的方法，所述方法包括：针对从所述非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述癌症生物样品中获得的包含至少一个启动子序列的分离的核酸进行映射；基于所述映射，生成针对所述至少一个启动子的测序标签计数矩阵；分析所述测序标签计数矩阵；及使用对所述测序标签计数矩阵的分析，确定所述核酸中所述至少一个启动子相对于所述参比核酸中所述至少一个启动子的差异富集，其中从所述受试者获得的癌症生物样品中所述至少一个启动子相对于非癌症样品中所述至少一个启动子的差异富集指示受试者体内存在与癌症相关的启动子。在另一方面，提供了一种用于确定至少一个启动子在癌症生物样品中相对于在非癌症生物样品中的活性的方法，所述方法包括：针对从所述非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述癌症生物样品中获得的包含至少一个启动子序列的分离的核酸进行映射；基于所述映射，生成所述至少一个启动子的测序标签计数矩阵；分析所述测序标签计数矩阵；及使用对所述测序标签计数矩阵的分析，确定所述核酸中所述至少一个启动子相对于所述参比核酸中所述至少一个启动子的差异活性。定义如本文所使用，术语“抗原结合蛋白”是指能够结合抗原的抗体、抗体片段及其它蛋白质构造，如结构域。术语“抗体”在本文中是以最广义使用，意思指具有免疫球蛋白样结构域的分子，并且包括单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体及异源缀合物抗体、单一可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双体抗体(diabody)、TandabsTM等(有关可选“抗体”形式的概述，参见Holliger及Hudson,《自然—生物技术》(Nature Biotechnology),2005,第23卷,第9号,1126-1136)。短语“单一可变结构域”是指独立于不同的可变区或结构域特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变结构域(例如VH、VHH、VL)。“结构域抗体”或“dAb”可以被认为与“单一可变结构域”相同，能够结合抗原。单一可变结构域可以是人类抗体可变结构域，而且还包括来自其它物种的单一抗体可变结构域，如啮齿动物(例如，如WO 00/29004中所公开)、护士鲨及骆驼VHHdAb。骆驼VHH是来源于包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼及大羊驼在内的产生天然地不含轻链的重链抗体的物种的免疫球蛋白的单一可变结构域多肽。此类VHH结构域可以根据本领域中可用的标准技术进行人源化，而且此类结构域被视为“结构域抗体”。如本文所使用，VH包括骆驼VHH结构域。如本文所使用，术语“结构域”是指具有独立于蛋白质其余部分的三级结构的折叠蛋白质结构。一般来说，结构域负责蛋白质的独特功能特性，并且在许多情形中，可以被添加、去除或转移到其它蛋白质，而不会使蛋白质其余部分和/或结构域的功能丧失。“单一可变结构域”是包含抗体可变结构域特有的序列的折叠多肽结构域。因此，单一可变结构域包括完整抗体可变结构域；及修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已经被并非抗体可变结构域特有的序列置换；或被截短的或包含N末端或C末端延伸的抗体可变结构域，以及可变结构域的至少保持全长结构域的结合活性和特异性的折叠片段。一个结构域可以独立于不同可变区或结构域来结合抗原或表位。抗原结合片段可以借助于在非抗体蛋白质支架如结构域上布置一个或多个CDR来提供。该结构域可以是结构域抗体，或者可以是经过蛋白质工程改造而实现与抗原的结合的支架的衍生物，该支架选自由以下组成的组：CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocalin)、SpA、Affibody、亲和性多聚体(avimer)、GroEl、转铁蛋白、GroES及纤连蛋白/adnectin。抗原结合片段或免疫有效片段可以包含部分重链或轻链可变序列。片段的长度是至少5、6、8或10个氨基酸。或者，这些片段的长度是至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定至少一个启动子在癌症生物样品中相对于在非癌症生物样品中的活性的方法，所述方法包括：针对从所述非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述癌症生物样品获得的包含至少一个启动子序列的分离的核酸进行映射，从而得到所述至少一个启动子的每百万每千碱基读段数(RPKM)值或每百万每千碱基片段数(FPKM)值；及使用所述RPKM值或FPKM值确定所述核酸中至少一个启动子序列相对于所述参比核酸序列中至少一个启动子的活性的差异活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.30 SG 201309689-61.一种确定至少一个启动子在癌症生物样品中相对于在非癌症生物样品中的活性的方法，所述方法包括：针对从所述非癌症生物样品获得的参比核酸，对从所述癌症生物样品获得的包含至少一个启动子序列的分离的核酸进行映射，从而得到所述至少一个启动子的每百万每千碱基读段数(RPKM)值或每百万每千碱基片段数(FPKM)值；及使用所述RPKM值或FPKM值确定所述核酸中至少一个启动子序列相对于所述参比核酸序列中至少一个启动子的活性的差异活性。2.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症生物样品和所述非癌症生物样品包括单个细胞、多个细胞、细胞碎片、体液或组织。3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述癌症生物样品和所述非癌症生物样品是从同一受试者获得的。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症生物样品和所述非癌症生物样品各自是从不同受试者获得的。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述核酸是通过染色质免疫沉淀而从所述癌症生物样品分离的，其中所述核酸包含所述至少一个启动子。6.如权利要求5所述的方法，其中染色质免疫沉淀是通过对修饰的组蛋白特异的抗体实现的。7.如权利要求6所述的方法，其中所述修饰的组蛋白包含选自由H3K4me3、H3K4me1及H3K27ac构成的组的至少一种组蛋白修饰。8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体对选自由H3K4me3、H3K4me1及H3K27ac构成的组的所述至少一种组蛋白修饰特异。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述包含至少一个启动子的分离的核酸是用至少一种引物被扩增的。10.如权利要求9所述的方法，其中所述被扩增的核酸用于构建含有所述被扩增的核酸的核酸序列文库。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述映射步骤包括基于相对于所述参比核酸，在被映射的核酸中所述至少一个启动子的总序列标签来计算所述RPKM值。12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述映射步骤包括基于相对于所述参比核酸，与在被映射的核酸中的所述至少一个启动子相关的识别的转录序列来计算所述FPKM值。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中确定所述至少一个启动子序列的差异活性的步骤包括确定在从所述癌症生物样品获得的核酸中的所述至少一个启动子的RKPM值或FPKM值：i)相对于从所述非癌症生物样品获得的所述参比核酸中的所述至少一个启动子的RKPM值或FPKM值，超过1到20倍之间的，如1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的平均RKPM值或FPKM值变化；及ii)相对于从所述非癌症生物样品获得的所述参比核酸中的所述至少一个启动子的RKPM值或FPKM值，超过0.1RPKM或FPKM范围。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中相对于总启动子群，所述至少一个启动子包含SUZ12结合位点的增加。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述至少一个启动子位于与细胞类型特化、胚胎发育或转录因子相关的基因附近。16.如权利要求15所述的方法，其中所述至少一个启动子位于与癌症相关的基因附近。17.如权利要求16所述的方法，其中所述基因是NKX6-3、SALL4、HOXB9、MET、TNK2、KLK1、FAR2、HOXA11或HOXA11-AS。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述癌症是胃癌。19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述至少一个启动子包含潜在启动子。20.一种用于确定受试者的癌症易感性的方法，所述方法包括针对从非癌症生物样品获得的参比核酸，对从癌症生物样品获得的包含至少一个启动子的分离的核酸进行映射，以获得所述至少一个启动子的RPKM值或FPKM值；及使用所述RPKM值或FPKM值确定所述核酸中所述至少一个启动子相对于所述参比核酸中所述至少一个启动子的活性的差异活性，其中相对于所述非癌症样品中所述至少一个启动子的活性，所述癌症样品中所述至少一个启动子的增加的活性指示所述受试...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文炜，村谷匡史，A·卡玛拉，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG