一种精准Fc位点共价偶联标记的生物素化抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种精准Fc位点共价偶联标记的生物素化抗体，本发明专利技术以基因工程技术表达带有光敏基团(Bpa)的Z亲和肽‑Avitag融合蛋白并BirA酶催化完成其生物素共价定点偶联，获得一种精准Fc位点偶联的生物试剂ZBpa‑Biotin，由亲和肽导向Fc位点亲和偶联后，继而在365nm紫外光激发光敏基团与抗体生产共价键，实现Fc位点的生物素共价偶联标记的生物素化抗体。本发明专利技术所提供的精准Fc位点的生物素化抗体，是一种Fc位点不可逆的共价偶联，不受pH、温度、有机溶剂及变性剂的影响，可在包被了亲和素的载体表面所固定的IgG抗体是均一、Fab段充分暴露及保持高抗原结合活性的三维定向IgG抗体，且在实际应用中突破了被分析物中不能有结合Z亲和肽物质的限制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程及免疫分析领域，具体的说是涉及一种生物素精准共价偶联抗体Fc位点的标记技术，该专利技术提供的精准Fc位点的生物素化抗体可在包被亲和素的载体表面实现牢固的定向固定，不影响抗体Fab段的抗原结合位点，且不受待测样品中内源性抗体的干扰。
技术介绍
生物素亲合素系统(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，亲合素与生物素一经结合，不受pH、温度、有机溶剂及变性剂的影响(使用变性剂且在>90℃的情况下才能解离)。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。生物素偶联标记抗体即生物素化抗体是BAS体系的应用前提，目前所采用的生物素化抗体制备技术是基于各种生物素衍生物(活化生物素)与抗体分子内的氨基酸残基(氨基、羰基)之间的共价偶联技术，一个抗体分子可连接多个生物素分子，由于抗体分子内活性氨基酸残基的数量、位置的不唯一性，生物素分子不能特异性地偶联在抗体的Fc段，当生物素分子随机地偶联于抗体Fab段，则会阻碍抗体的抗原结合而导致抗体结合抗原活性下降。利用某些抗体亲和蛋白可实现抗体Fc端的间接标记，如葡萄球菌蛋白A(SpA)及其衍生蛋白(ZZ亲和肽)，能通过疏水作用结合多种动物IgG的Fc段，且这种结合不影响IgG的Fab段与抗原特异性结合的免疫活性。ZZ亲和肽是源自葡萄球菌蛋白A的B结构域的重复序列，每个ZZ亲和肽分子可结合两个IgG分子，而单个的Z序列(Z亲和肽)可结合IgG分子的一条重链，因而一个IgG分子可结合两个单个的Z序列。我们曾利用定点生物素化的ZZ亲和肽实现了抗体Fc端的生物素亲和偶联(专利技术专利CN103694358B《位点特异性生物素标记重组及其在三维定向固定IgG抗体中的应用》)。然而，亲和肽与IgG之间的结合是一种可逆的生物结合，该抗体定向固定技术应用于基于芯片技术的免疫分析中，在芯片的再生过程中亲和肽-IgG的结合物会解离，需重复结合捕获抗体；更为重要的是，在临床样品分析中如果含有与亲和肽结合的IgG类物质，则会严重干扰分析结果，继而限制了这种由亲和肽介导的抗体定向固定技术的应用范围。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术以基因工程技术表达带有光敏基团(4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，p-benzoylphenylalanine，简称Bpa)的Z亲和肽-Avitag融合蛋白并以BirA酶催化完成其生物素共价定点偶联，获得一种精准Fc位点偶联的生物试剂ZBpa-Biotin，由Z亲和肽导向Fc位点亲和偶联后，继而在365nm紫外光激发光敏基团与抗体生产共价键，实现Fc位点的生物素共价偶联标记的生物素化抗体。因一个IgG分子可结合两个单个的Z序列，本专利技术所提供的精准Fc位点的生物素化抗体，是每个IgG分子可定量结合两个Biotin分子，且是一种不可逆的共价偶联生物素抗体，不受pH、温度、有机溶剂及变性剂的影响，可实现固相载体表面所固定的IgG抗体是均一、Fab段充分暴露及保持高抗原结合活性的三维定向IgG抗体，且在实际应用中突破了被分析物中不能有结合Z亲和肽物质的限制。本专利技术利用氨酰tRNA合成酶/抑制琥珀tRNA(aminoacyl-tRNAsynthetase/ambersuppressortRNA，aaRS/suppressortRNA)技术实现在蛋白质的翻译过程中即生物合成含光敏基团的目的蛋白质。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种精准导向Fc位点偶联的生物试剂(简称ZBpa-Biotin)，该生物试剂包括一Z亲和肽，其特点是：所述Z亲和肽的α1结构域处连接有4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，所述Z亲和肽的羧基末端残基处依次连接Avi-tag标签蛋白和多聚组氨酸纯化标签蛋白，其中所述Avi-tag标签蛋白上的赖氨酸残基上连接生物素或其衍生物。优选的，从光照后与IgG抗体偶联效果来讲，所述α1结构域处连接有4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸的部位为氨基酸的第17位置。第17位置是指在Z亲和肽的第16个氨基酸之后第17个氨基酸前的位置。优选的，所述多聚组氨酸纯化标签蛋白为为6聚组氨酸(6×His)。本专利技术的第二个目的是提供上述精准Fc位点偶联的生物试剂的制备方法，包括以下步骤：(1)首先构建重组质粒pZTAG–Avitag表达载体：其中，目的基因的合成为：首先根据Z亲和肽基因序列，在Z亲和肽基因序列的α1结构域序列所需位点处插入琥珀密码子(TAG)，然后在Z亲和肽基因序列下游末端、多聚组氨酸纯化标签基因序列置入Avitag基因序列，最后在上述基因序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶酶切位点，化学合成得到目的基因序列；(2)然后利用原核微生物表达出重组蛋白ZBpa–Avitag；(3)最后利用生物素连接酶(BirA酶)对重组蛋白ZBpa–Avitag生物素化，得到生物素化的重组蛋白ZBpa–Avitag，即为该生物试剂(ZBpa-Biotin)。步骤(1)中，重组质粒表达载体的制备为本领域技术人员知晓的常规技术手段。基本步骤是：化学合成目的基因序列后，将其克隆至质粒中，即可获得相应的质粒表达载体。在本专利技术优选的一个具体实施例中，将目的基因序列亚克隆至pTBX1质粒中，获得重组质粒pZTAG–Avitag表达载体。优选的，所述多聚组氨酸纯化标签基因序列为6聚组氨酸基因序列。所述限制性内切酶并没有特别限定，可以根据需求进行设定。在本专利技术优选的一个具体实施例中，所述目的基因的5'端设置NdeI限制性内切酶酶切位点，所述目的基因的3'端设置XhoI限制性内切酶酶切位点；在本专利技术优选的一个具体实施例中，所述目的基因的序列为：5’-CATATGGTAGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAACGCGTTCTATGAGATCTAGCATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGAAACGCCTTCATCCAAAGTTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAGGCGCCGAAAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACATCATCATCATCATCATTAACTCGAG-3’，如SEQIDNO.1所示。其中，双下划线表示的碱基是琥珀密码子，单下划线表示的序列是限制性内切酶酶切位点，粗体序列表示的是6聚组氨酸基因序列，斜体序列表示Avi-tag的氨基酸基因序列。步骤(2)中，重组蛋白ZBpa–Avitag包括Z亲和肽，所述Z亲和肽的α1结构域处连接有4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，所述Z亲和肽的羧基末端残基处依次连接Avi-tag标签蛋白和多聚组氨酸纯化标签蛋白。为实现目的蛋白在蛋白质的翻译过程中即生物合成含光敏基团的目的蛋白质，步骤(1)中的表达载体与含有氨酰tRNA合成酶编码基因的pEVOL-pBpF共转化至原核生物中，获得基因工程菌。利用该基因工程即可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种精准导向Fc位点偶联的生物试剂，该生物试剂包括Z亲和肽，其特征是：所述Z亲和肽的α1结构域处连接有4‑苯甲酰基‑L‑苯丙氨酸，所述Z亲和肽的羧基末端残基处依次连接Avi‑tag标签蛋白和多聚组氨酸纯化标签蛋白，其中所述Avi‑tag标签蛋白上的赖氨酸残基上连接生物素或其衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种精准导向Fc位点偶联的生物试剂，该生物试剂包括Z亲和肽，其特征是：所述Z亲和肽的α1结构域处连接有4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸，所述Z亲和肽的羧基末端残基处依次连接Avi-tag标签蛋白和多聚组氨酸纯化标签蛋白，其中所述Avi-tag标签蛋白上的赖氨酸残基上连接生物素或其衍生物。2.权利要求1所述的精准导向Fc位点偶联的生物试剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)首先构建重组质粒pZTAG–Avitag表达载体：其中，目的基因的合成为：首先根据Z亲和肽基因序列，在Z亲和肽基因序列的α1结构域序列所需位点处插入琥珀密码子(TAG)，然后在Z亲和肽基因序列下游末端、多聚组氨酸纯化标签基因序列置入Avitag基因序列，最后在上述基因序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶酶切位点，化学合成得到目的基因序列；(2)然后步骤(1)中的表达载体利用原核微生物表达出重组蛋白ZBpa–Avitag；(3)最后利用生物素连接酶对重组蛋白ZBpa–Avitag生物素化，得到生物素化的重组蛋白ZBpa–Avitag，即为该生物试剂(ZBpa-Biotin)。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，将目的基因序列亚克隆至pTBX1质粒中，获得重组质粒pZTAG–Avitag表达载体；优选的，所述多聚组氨酸纯化标签基因序列为6聚组氨酸基因序列；优选的，所述目的基因的5'端设置NdeI限制性内切酶酶切位点，所述目的基因的3'端设置XhoI限制性内切酶酶切位点；优选的，所述目的基因序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，所述表达载体与含有氨酰tRNA合成酶编码基因的pEVOL-pBpF共转化至原核生物中，获得基因工程菌；优选的，将所述基因工程菌30～37℃经过12～18h培养、活化后，转接到2×YT培养基中，37℃培养至OD600为0.6–0.8；然后加入4-苯甲酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨洪鸣，唐金宝，鲍如梦，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37