类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法技术

本发明专利技术属于蛋白质工程和分子生物学技术领域，公开了一种类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，合成经筛选优化的SCARA5类胶原结构域序列和目的蛋白表达基因，构建至昆虫细胞表达载体，获得重组载体：优化得到类胶原序列编码基因的核苷酸序列，通过PCR及测序确定载体构建正确；将载体转入DH10Bac大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选获得重组成功的大肠杆菌，并提取其中的Bacmid；将Bacmid转染Sf9细胞，获取P3代的病毒以备蛋白表达；通过P3代病毒感染Hi5细胞，表达目的蛋白，纯化目的蛋白；监测得到的分泌蛋白的总量的增加效果。本发明专利技术增强分泌型受体蛋白的分泌表达量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质工程和分子生物学，尤其涉及一种类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法。

技术介绍

1、目前，通过昆虫系统重组表达哺乳动物细胞表面受体蛋白被广泛应用到生化分子及结构生物学研究中，但众多受体蛋白的表达分泌量较低。获取足够的蛋白进行研究或应用需要大量表达，成本高，耗时费力，并且拿到的蛋白纯度低，难以支撑起其对应的科学研究和市场的应用。scara5是清道夫受体a家族的成员，其羧基端含有一个类胶原结构域(cl)和一个半胱氨酸富集结构域(srcr)。在前期研究scara5功能时偶然发现，scara5的srcr结构域在单独分泌表达时难以分泌，很难获得目的蛋白，但在加入类胶原结构域共同表达时(cl-srcr)分泌量得到显著增加，分泌得到的蛋白呈现单体形式。并且类胶原结构域在分泌后会自发降解，最终留存一段短肽，不影响srcr结构域的生化性质。基于此发现的提示，本专利技术涉及优化改造后的上述类胶原肽，并应用其在昆虫细胞系统中，表达分泌多种类型的目的受体蛋白。

2、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：部分分泌型受体蛋白通过昆虫表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，所述第一步中优化的SCARA5氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，经添加终止密码子和密码子优化得到类胶原序列编码基因的核苷酸序列，通过PCR及测序确定载体构建正确；与原始型基因相比其具体突变的残基分别为K7L,K12A,R34A,D79L。

3.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过基因合成优化的类胶原结构域和目的蛋白的编码基因，随后使用高保真酶通过重...

【技术特征摘要】

1.类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，所述第一步中优化的scara5氨基酸序列如seq id no：1所示，经添加终止密码子和密码子优化得到类胶原序列编码基因的核苷酸序列，通过pcr及测序确定载体构建正确；与原始型基因相比其具体突变的残基分别为k7l,k12a,r34a,d79l。

3.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过基因合成优化的类胶原结构域和目的蛋白的编码基因，随后使用高保真酶通过重叠延伸pcr的方法，将优化的类胶原结构域以及目的蛋白两者的编码基因连接至一条基因片段，其中类胶原结构域位于目的基因的氨基端，pcr得到的目的基因片段经过琼脂糖凝胶回收后，将回收的基因片段与例如含有信号肽的昆虫细胞表达载体进行连接，使蛋白的表达顺序为信号肽-类胶原结构域-目的蛋白，最后通过测序对插入片段的正确性进行验证；表达载体为含有信号肽的pfastbac系列载体，信号肽不仅限于melitten。

4.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过杆状...

【专利技术属性】
技术研发人员：于博文，刘志军，王宁宁，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：