【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质工程和分子生物学，尤其涉及一种类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法。
技术介绍
1、目前，通过昆虫系统重组表达哺乳动物细胞表面受体蛋白被广泛应用到生化分子及结构生物学研究中，但众多受体蛋白的表达分泌量较低。获取足够的蛋白进行研究或应用需要大量表达，成本高，耗时费力，并且拿到的蛋白纯度低，难以支撑起其对应的科学研究和市场的应用。scara5是清道夫受体a家族的成员，其羧基端含有一个类胶原结构域(cl)和一个半胱氨酸富集结构域(srcr)。在前期研究scara5功能时偶然发现，scara5的srcr结构域在单独分泌表达时难以分泌，很难获得目的蛋白，但在加入类胶原结构域共同表达时(cl-srcr)分泌量得到显著增加，分泌得到的蛋白呈现单体形式。并且类胶原结构域在分泌后会自发降解，最终留存一段短肽，不影响srcr结构域的生化性质。基于此发现的提示，本专利技术涉及优化改造后的上述类胶原肽，并应用其在昆虫细胞系统中，表达分泌多种类型的目的受体蛋白。
2、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：部分分泌型受体蛋白通过昆虫表达系统进行分泌表达时，表达量低，难以满足相关研究的需求。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法。
2、本专利技术是这样实现的，类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，所述类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，包括以下步骤：p>
3、第一步，合成经突变筛选的优化型scara5类胶原结构域序列和目的蛋白表达基因，并以信号肽，类胶原序列，目的基因的顺序构建至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；
4、第二步，将载体转入dh10bac大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选获得重组成功的大肠杆菌，并提取其中的bacmid；
5、第三步，将bacmid转染sf9细胞，包装杆状病毒，获取p3代的病毒以备蛋白表达；
6、第四步，通过p3代病毒感染hi5细胞，表达目的蛋白，通过亲和纯化凝胶色谱层析方式，纯化目的蛋白；
7、第五步，监测得到的分泌蛋白总量的增加效果。
8、进一步，所述第一步中优化的scara5氨基酸序列如seq id no：1所示，筛选优化后的序列与原始型基因相比其具体突变的残基分别为k7l,k12a,r34a,d79l。经添加终止密码子和密码子优化得到类胶原序列编码基因的核苷酸序列，通过pcr及测序确定载体构建正确。
9、进一步，所述第一步中通过基因合成优化的类胶原结构域和目的蛋白的编码基因，随后使用高保真酶通过重叠延伸pcr的方法，将优化的类胶原结构域以及目的蛋白两者的编码基因连接至一条基因片段，其中类胶原结构域位于目的基因的氨基端，pcr得到的目的基因片段经过琼脂糖凝胶回收后，将回收的基因片段与例如含有信号肽的pfastbac-melitten昆虫细胞表达载体进行连接，使蛋白的表达顺序为信号肽-类胶原结构域-目的蛋白，最后通过测序对插入片段的正确性进行验证。
10、进一步，所述第二步中将20ng重组质粒加入dh10bac感受态细胞中，混匀后在冰上静置15min随后42℃热激60s，后加入1ml无抗的lb培养基于37℃震荡220rpm复苏4hr；最后分为20μl，10μl，5μl进行梯度均匀涂布于三抗lb平板(含有100μg/ml x-gal，50μg/ml kan+，10μg/ml tet+，7μg/ml gen+，1mm iptg)，平板置于37℃培养箱培养约两天。挑取单克隆白色菌落于3ml三抗lb培养基中(50μg/ml kan+，10μg/ml tet+，7μg/ml gen+)，37℃振荡培养10hr，抽取bacmid。
11、进一步，通过以下方式抽提bacmid：12000g收集菌液，加入150μl溶液i(25mm葡萄糖，150mm nacl，25mm tris，ph 8.0)重悬菌体，加入200μl溶液ii(0.2m naoh，1％sds)轻柔混匀，静止约5min至菌液完全裂解后，加入200μl溶液iii(1.5m hac，1m kac)轻柔混匀。14000g离心15min，转移450μl上清至新管中，加入2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃静止2hr。随后14000g离心15min，弃去上清，于55℃金属浴烘干乙醇。通过80μl双蒸水静置15min溶解bacmid，随后通过分光光度计测量核酸浓度。取0.5μl bacmid通过pcr鉴定片段是否插入，将正确的bacmid过滤除菌，4℃保存备用。
12、进一步，所述第三步进行杆状病毒的包装流程，取对数期生长的sf9细胞，铺于6孔板中，密度约为0.8×106个/孔。待细胞贴到6孔板底部后(约15min)，吸弃上清培养基，每孔加入2ml的grace培养基(invitrogen)，放入27℃细胞培养箱中。加入100μl grace培养基至无菌的ep管中，加入7μl cellfection ii并涡旋震荡混匀，放置约30min。将4μg的bacmid溶于100μl grace培养基中，并与cellfection ii溶液混合，放置25min。将混合液加入到6孔板中，放置约4hr后洗去培养基，加入sf900 ii insect medium。约5天后，收取上清。取少量上清进行western bloting鉴定，扩增并保存包装成功的p1代病毒。
13、进一步，p2代病毒的制备，取t25 flask，每瓶加4ml esf921完全培养基，加sf9细胞，用手稍摇晃使细胞分散均匀，置于培养箱中，待细胞铺满底部80％，移除多余悬浮细胞，加4ml esf921完全培养基，加p1代病毒500μl，置于昆虫培养箱，p2代病毒大约4天，待细胞裂解，取样离心后做western检测，确认是否有目标蛋白的生成。收集p2代病毒，后取t75flask，每瓶加8ml esf921完全培养基，铺细胞，加p2代病毒500μl混匀，培养4天后观察细胞裂解状态，收集p3代病毒，可暂存于4℃。将收集的p3代病毒，取样进行western-blot实验，比较加入类胶原结构域的蛋白表达量增加情况。
14、进一步，所述第四步中不断扩增high-five细胞，培养至1l，300-400ml/瓶，稀释密度为2.5x106 cells/ml，每瓶加p3代病毒约2ml，摇床培养3天。蛋白表达完成后，将其从细胞房摇床中取出，倒入洁净大烧杯中，分装离心管并配平，13000g离心20min，收集上清，注意勿将细胞沉淀倒出。在纯化前取样进行western-blot实验，比较加入类胶原结构域的蛋白表达量增加情况。
15、进一步，荧光蛋白的表达情况直接通过检测酶标仪比较荧光强度数值进行分析。
16、进一步，通过亲和纯化方式对目的蛋白进行纯化，通过蠕动泵将上述得到的上清，经过ni smart beads进行纯化，流速在0.5ml/mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，所述第一步中优化的SCARA5氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，经添加终止密码子和密码子优化得到类胶原序列编码基因的核苷酸序列，通过PCR及测序确定载体构建正确；与原始型基因相比其具体突变的残基分别为K7L,K12A,R34A,D79L。
3.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过基因合成优化的类胶原结构域和目的蛋白的编码基因，随后使用高保真酶通过重叠延伸PCR的方法，将优化的类胶原结构域以及目的蛋白两者的编码基因连接至一条基因片段，其中类胶原结构域位于目的基因的氨基端，PCR得到的目的基因片段经过琼脂糖凝胶回收后，将回收的基因片段与例如含有信号肽的昆虫细胞表达载体进行连接，使蛋白的表达顺序为信号肽-类胶原结构域-目的蛋白，最后通过测序对插入片段的正确性进行验证；表达载体为含有信号肽的pFastbac系列载体，信号肽不仅限于melitten。
4.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过杆状病毒表达系统进行病毒的包装，使用的宿主细胞包括Sf9，Hi5细胞。
5.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，完成P3代病毒的包装后，取样病毒样本进行Western-Blot实验，比较加入类胶原结构域的蛋白表达量增加情况。
6.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，蛋白表达完成后，收集上清，在纯化前取样进行Western-Blot实验，比较加入类胶原结构域的蛋白表达量增加情况。
7.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，蛋白表达完成后，通过包括His，GST，MBP等标签的亲和纯化方式对目的蛋白进行纯化，纯化得到的样品经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行检测，判断蛋白纯度，初步判定比较蛋白总量；随后将得到的蛋白通过AKTA凝胶色谱层析方式进行纯化，收取对应蛋白峰进行浓缩，通过A280吸光度结合消光系数计算最终得到的蛋白量，并与为加入类胶原结构域的实验组进行比较。
8.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，荧光蛋白的表达情况直接通过检测酶标仪比较荧光强度数值进行分析。
...【技术特征摘要】
1.类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，所述第一步中优化的scara5氨基酸序列如seq id no：1所示，经添加终止密码子和密码子优化得到类胶原序列编码基因的核苷酸序列，通过pcr及测序确定载体构建正确；与原始型基因相比其具体突变的残基分别为k7l,k12a,r34a,d79l。
3.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过基因合成优化的类胶原结构域和目的蛋白的编码基因，随后使用高保真酶通过重叠延伸pcr的方法，将优化的类胶原结构域以及目的蛋白两者的编码基因连接至一条基因片段，其中类胶原结构域位于目的基因的氨基端，pcr得到的目的基因片段经过琼脂糖凝胶回收后，将回收的基因片段与例如含有信号肽的昆虫细胞表达载体进行连接，使蛋白的表达顺序为信号肽-类胶原结构域-目的蛋白，最后通过测序对插入片段的正确性进行验证；表达载体为含有信号肽的pfastbac系列载体，信号肽不仅限于melitten。
4.如权利要求1所述的类胶原序列增强重组受体蛋白在昆虫细胞中分泌的方法，其特征在于，通过杆状...
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