一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法技术

本发明专利技术属于酶的固定化技术领域，尤其涉及一种共价交联法固定纤维素酶及其酶解人参皂苷‑Rb1制备人参皂苷‑Rd的方法。固定化酶由卡拉胶经聚乙烯亚胺胺化，戊二醛交联，酶的固定化三步制得。与单纯使用游离酶相比，本方法具有可回收利用、选择性高和无污染等优点，与其他酶固定化方法相比，本方法具有结合牢固、操作稳定、可多次反复利用等诸多优点，更适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶的固定化
，尤其涉及一种共价交联法固定纤维素酶及其酶解人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法。
技术介绍
人参皂苷-Rd属于四环三萜达玛烷型中的原人参二醇型皂苷。研究表明，原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷，在体内的主代谢途径均是通过脱糖反应生成药理活性更好的次级苷和苷元，肠道酶把原人参二醇型人参皂苷-Rb1代谢为-Rd。因此，人参皂苷-Rd是原人参二醇型皂苷的代谢后被肠道吸收利用的重要形式之一。人参皂苷-Rd具有保护心血管系统、抗肿瘤、免疫调节、神经保护等作用。目前，制备次级皂苷主要有酸水解法、碱水解法、Smith降解和酶解法。前三种方法效率高，但是副产物较多，专一性差，环境污染严重，不易进行工业化生产，而酶解法具有工艺条件温和、选择性高及无污染等特点。然而，游离酶（如游离蜗牛酶、橙皮苷酶等），存在稳定性差、不可回收及生产成本高的缺点。酶固定化后再进行催化反应时，酶具有易回收、易分离、反复多次使用等优点，可以弥补天然酶在催化反应中的应用缺陷。酶的固定化技术，是现代生物技术及其工业化环节中的一个核心技术，固定化酶在工业、医学、分析与分离技术以及化学合成等领域有着广泛的用途。依据酶的性质和用途，可通过包埋法、交联法、吸附法和共价结合法来实现酶的固定化（罗贵民，酶工程，北京：化学工业出版社，2003，55-67.）；张琪等人比较琼脂法、包埋法、海藻酸钠戊二醛包埋交联法、交联包埋法固定β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷-Rg1为人参皂苷-F1的转化工艺（张琪，赵文倩，孟飞，等.固定化β-葡萄糖苷酶制备人参皂苷F1的研究[J].中国抗生素杂志，2012，37(1)：49-55.）；于兆慧等采用交联-包埋法利用多孔二氧化硅吸附固定化蜗牛酶，海藻酸制备成微球，考察固定化蜗牛酶转化人参皂苷Rb1制备CK的工艺条件（于兆慧，刘其媛，崔莉，等.微球固定化蜗牛酶转化人参皂苷Rb1制备人参稀有皂苷CompoundK研究[J].中草药，2014，45（21）：3092-3097.）；专利CN101012473A采用海藻酸钠固定化技术包埋转化菌及酶，和聚乙烯氧化物为载体共价结合法以三醇型人参皂苷-Rg1制备生产人参皂苷-F1；专利CN101481725A采用壳聚糖吸附及戊二醛交联转化人参皂苷-Rb1制备-F2；专利CN1899336A采用海藻酸钠包埋β-葡聚糖苷酶、纤维素酶、纤维二糖酶转化三七茎叶皂苷为CK。然而，上述的现有技术中仅应用包埋法和交联法，酶存在结合力弱，易失活且接触表面积小的缺点。综上所述，研究一种新型的、能够提高酶活性的酶固化技术，显得尤为重要。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法。采用共价交联法，确定纤维素酶的最佳固定工艺，然后以固定化酶转化西洋参二醇组皂苷，得到较高产率的人参皂苷-Rd。为了实现上述目的，本专利技术提供共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法，包括以下步骤。步骤1、卡拉胶的胺化：取适量的浓度为10-40mg/ml的卡拉胶水溶液，温度为65℃的条件下，搅拌，得卡拉胶混悬液；取4℃的浓度为2%KCl水溶液（重量比），置于烧杯中，放在磁力搅拌器上搅拌，并吸取卡拉胶混悬液缓慢滴入其中，形成透明半球状凝胶珠，静置，制成卡拉胶凝胶珠；称取适量的卡拉胶凝胶珠，加入浓度为0.05-3%的聚乙烯亚胺溶液，滴加碱溶液，调节pH为7.0-12.0，胺化时间为0.25-4h，放在滚轴混合器上混合，蒸馏水洗，洗净残余聚乙烯亚胺，备用。步骤2、交联反应：取适量的步骤1得到的胺化的卡拉胶凝胶珠，加入浓度为0.1-4%戊二醛溶液，交联时间为0.5-5.0h，放在滚轴混合器上混合，用蒸馏水清洗，洗净残余戊二醛，加入纤维素酶溶液，放在滚轴混合器上混合，完成酶的固定化，即得固定纤维素酶，并测定固定化酶的活力。步骤3、西洋参二醇组皂苷的制备：西洋参干燥根及根茎粗粉用水煎提取，水液减压浓缩，然后上D101大孔吸附树脂分离，吸附12h，水洗后用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸除溶剂，制得西洋参二醇组皂苷干燥粉末。步骤4、酶解反应：取适量的步骤3制备的西洋参二醇组皂苷粉末，配置成浓度为0.5-5mg/ml的西洋参二醇组皂苷溶液，加入步骤2得到的固定纤维素酶，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值为3.0-9.0，反应温度为30-70℃，反应时间为12-24h；利用高效液相法测定人参皂苷-Rb1转化情况。所述的卡拉胶混悬液的滴距为6cm，滴速为70-80滴/min。所述的碱溶液为氢氧化钠溶液。所述的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值优选为5.0。本专利技术的有益效果。本专利技术中，提供了一种新的采用固定化酶转化人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法，直接以西洋参二醇组皂苷为底物，所应用的酶为固定化纤维素酶。固定化酶由卡拉胶经聚乙烯亚胺胺化，戊二醛交联，酶的固定化三步制得；其中，聚乙烯亚胺胺化时，卡拉胶控制滴加速度70-80滴/min。卡拉胶凝胶珠上表面的羟基与聚乙烯亚胺（PEI）上的氨基结合，使得凝胶珠表面孔隙变小，阻止游离酶在凝胶珠内部的进出；戊二醛交联时，胺化后的卡拉胶凝胶珠与戊二醛上的一个醛基交联完成活化，戊二醛的另一个醛基与酶蛋白上的氨基发生Schiff反应，使酶牢固地结合在凝胶珠载体上。经聚乙烯亚胺及戊二醛活化后的凝胶珠质地紧密牢固，不易被破坏，且酶与凝胶珠通过共价键结合，结合紧密，不易断裂。本专利技术提供的酶固定化方法，易于与反应体系分离；具有一定的机械强度，便于酶催化反应的连续化和自动化操作；重复利用9次后，固定化酶对人参皂苷-Rb1的转化相对活力依然保持45%以上，极大节约生产成本。与单纯使用游离酶相比，本方法具有可回收利用、选择性高和无污染等优点，与其他酶固定化方法相比，本方法具有结合牢固、操作稳定、可多次反复利用等诸多优点，更适合工业化生产。附图说明图1对硝基苯酚标准曲线。图2西洋参二醇组皂苷HPLC图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做详细的说明。实施例1。纤维素酶的共价固定工艺。称取0.25g卡拉胶（采购于北京索莱宝公司）加入到25ml蒸馏水中，温度为65℃条件下，用磁力搅拌器搅拌1h，转速为300rpm，得卡拉胶混悬液；取4℃的2%的KCl溶液50ml置于烧杯中，放在磁力搅拌器上搅拌，转速为300rpm，并用5ml注射器吸取卡拉胶混悬液，缓慢滴入其中（滴入过程中固定滴距为6cm，滴速为80滴/min），瞬时形成透明半球状凝胶珠，并在2%KCl溶液中放置3h，制成浓度为1%卡拉胶凝胶珠；取1g卡拉胶凝胶珠，加入10ml浓度为1%聚乙烯亚胺溶液，滴加10%的NaOH溶液调节pH值为10，放在滚轴混合器上混合胺化1h，转速为50rpm，蒸馏水洗3遍，洗净残余聚乙烯亚胺；再加入到的10ml0.5%戊二醛中，放在滚轴混合器上混合进行交联2h，转速为50rpm，蒸馏水洗3遍，洗净残余戊二醛；加入4ml浓度为2.5U/ml纤维素酶溶液（10U）（采购于北京索莱宝公司，批号923C021），放在滚轴混合器上混合16h，转速为50rpm，完成酶的固定化。实施例2。纤维素酶的共价固定工艺。称取0.5g卡拉胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷‑Rb1制备人参皂苷‑Rd的方法，其特征在于，包括以下步骤：卡拉胶的胺化；交联反应；西洋参二醇组皂苷的制备；酶解反应；利用高效液相法测定人参皂苷‑Rb1转化情况。

【技术特征摘要】
1.一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法，其特征在于，包括以下步骤：卡拉胶的胺化；交联反应；西洋参二醇组皂苷的制备；酶解反应；利用高效液相法测定人参皂苷-Rb1转化情况。2.如权利要求1所述的制备人参皂苷-Rd的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1、卡拉胶的氨化：取适量的浓度为10-40mg/ml的卡拉胶水溶液，温度为65℃的条件下，搅拌，得卡拉胶混悬液；取4℃的浓度为2%NaCl水溶液（重量比），置于烧杯中，放在磁力搅拌器上搅拌，并吸取卡拉胶混悬液缓慢滴入其中，并缓慢加入卡拉胶混悬液，形成透明半球状凝胶珠，静置，制成卡拉胶凝胶珠；称取适量的卡拉胶凝胶珠，加入浓度为0.05-3%的聚乙烯亚胺溶液，滴加碱溶液，调节pH为7.0-12.0，胺化时间为0.25-4h，放在滚轴混合器上混合蒸馏水洗，洗净残余聚乙烯亚胺，备用；步骤2、交联反应：取适量的步骤1得到的胺化的卡拉胶凝胶珠，加入戊二醇溶液，交联反应后，放在滚轴混合器上混合，用蒸馏水洗，洗净残余戊二醇，加入纤维素酶溶液，放在滚轴混合器上混合，完成酶的固定化，即得固定纤维素酶，并测定固定化酶的活力；步骤3、西...

【专利技术属性】
技术研发人员：窦德强，冉小库，默罕默德·艾尔赛义德·阿里·哈桑，袁颖，栾晓宁，
申请(专利权)人：辽宁中医药大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21