一种稀有人参皂苷Rh2的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种稀有人参皂苷Rh2的生产方法，属于人参皂苷的酶催化合成领域。本发明专利技术公开的人参皂苷Rh2的生产方法以原人参二醇为底物，以枯草芽孢杆菌（Bacillus sutbilis 168）中筛选获得的糖基转移酶YjiC或YojK为催化剂，通过体外酶反应高效的催化原人参二醇的C3位羟基糖基化生成人参皂苷Rh2。本发明专利技术原料价廉，人参皂苷Rh2的得率高，生产成本低，可实现名贵稀有人参皂苷Rh2的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种由原人参二醇生产人参皂苷Rh2的方法，更具体地说，涉及一种利用糖基转移酶YjiC或YojK对原人参二醇的C3位羟基糖基化以生产人参皂苷Rh2的方法。
技术介绍
人参皂苷Rh2（ginsenosideRh2），俗称护命素，因其具有护命延生的作用而得名。人参皂苷Rh2是人参中最主要的抗肿瘤活性物质之一，具有抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞端粒酶的活性、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤细胞转移、逆转肿瘤细胞的异常分化等功效，从而具有良好的抗肿瘤及防治肿瘤复发转移的功效。在临床上，人参皂苷Rh2与放疗和化疗等治疗方式相结合，可以增强放疗和化疗在癌症治疗上的效果。此外，人参皂苷Rh2还具有抗过敏、提高免疫、抗疲劳和抗炎等一系列的生理功能。人参皂苷Rh2是人参中含量极其稀少的一种人参皂苷，其在红参中的含量只有十万分之一左右，而在白参中几乎不存在。目前，人参皂苷Rh2的生产有三种方式。（1）以中药材人参中提取获得的人参总皂苷为原料，利用酸水解、碱水解、酶法水解以及微生物发酵水解的方式对人参总皂苷进行水解生产人参皂苷Rh2，由于人参生长周期长、生长条件苛刻、人参总皂苷含量低、提取工艺复杂以及人参皂苷Rh2的得率低，导致人参皂苷Rh2的生产成本极高，难以满足其大规模工业化生产的要求。（2）以人参皂苷Rh2的前体物质—原人参二醇为底物，通过化学法进行糖基化修饰生产人参皂苷Rh2，化学法合成路线复杂、成本较高、转化率低、立体选择性差并且有大量副产物的生成，近年来已经很少使用。（3）利用合成生物学技术在微生物细胞工厂中构建人参皂苷Rh2的生物合成途径生产人参皂苷Rh2（Wang,Pingping,etal.\ProductionofbioactiveginsenosidesRh2andRg3bymetabolicallyengineeredyeasts.\Metabolicengineering29(2015):97-105.）；但是，人参皂苷Rh2对微生物细胞具有较高的毒性，导致微生物细胞工厂难以大量合成人参皂苷Rh2，同样满足不了工业化生产的需求。原人参二醇是人参皂苷Rh2的前体物质，其价格较为廉价，且通过整合原人参二醇生物合成相关基因可以在酿酒酵母细胞工厂中大量生产原人参二醇（Dai,Zhubo,etal.\MetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforproductionofginsenosides.\Metabolicengineering20(2013):146-156.）。同时，酶促反应具有催化效率高、专一性强、底物耐受性好、产物纯化简单等特点。因此，以价格较为低廉且供应充足的原人参二醇为底物，挖掘表达量高、催化活性高、区域及立体选择性强的糖基转移酶在体外对原人参二醇进行糖基化修饰可以大量地生产价格极其高昂的人参皂苷Rh2。相对于植物（如：人参）中筛选获得的糖基转移酶，从微生物中筛选获得的糖基转移酶通常具有更宽广的底物谱和更高的酶活，其催化糖基化的方式也更具多样性，甚至可能获得一些非天然的糖基化产物。例如，来自抗生链酶菌的糖基转移酶OleD对137种不同的底物均有较高的活性，这些底物很多都是植物中的天然产物（GanttRW,GoffRD,WilliamsGJ,etal.Probingtheaglyconpromiscuityofanengineeredglycosyltransferase[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2008,47(46):8889-8892）。因此，从微生物中开展糖基转移酶的挖掘工作，可能发现对人参皂苷活性高以及甚至可以合成新型人参皂苷的糖基转移酶。
技术实现思路
技术问题目前，人参皂苷Rh2的生产方法包括人参总皂苷的水解、原人参二醇的化学法催化及微生物细胞工厂的生物合成。人参总皂苷水解生产人参皂苷Rh2受原料稀缺、提取工艺复杂、产物得率低的影响导致Rh2的生产成本较高，难以满足其大规模工业化生产的需求。另外，化学法对原人参二醇进行糖基化修饰生产人参皂苷Rh2存在合成路线复杂、成本较高、转化率低、立体选择性差并且有大量副产物生成等技术问题。同时，由于人参皂苷Rh2对微生物细胞具有较高的毒性，难以通过合成生物学的方法在微生物细胞工厂中对其大量合成。因此，本专利技术一方面是提供一种人参皂苷Rh2的生产方法，其与之前生产人参皂苷Rh2的典型方法相比更为经济和高效并能满足工业化生产需求。技术解决方案本专利技术的实施例提供一种人参皂苷Rh2的生产方法，包括：以原人参二醇为底物，以UDP-葡萄糖为糖基供体，利用新挖掘获得的表达量高、催化活性强的糖基转移酶对其C3位羟基糖基化生成人参皂苷Rh2；纯化所述糖基化产物；以及结晶经纯化的糖基化产物。有益效果本专利技术提供一种以价格低廉且供应充足的原人参二醇作为原料，利用新挖掘获得的高效的糖基转移酶在体外对原人参二醇进行糖基化修饰生产人参皂苷Rh2的方法,从而避免了人参总皂苷的水解、原人参二醇的化学法催化及微生物细胞工厂的生物合成生产Rh2的过程中存在生产成本高、提取工艺复杂、产物得率低、副产物多、等问题，以更经济、更高效的方式生产人参皂苷Rh2，从而促进其规模化生产。附图说明图1是人参皂苷Rh2和F12的合成方法。图2是SDS-PAGE分析糖基转移酶YjiC的表达情况。图3是SDS-PAGE分析糖基转移酶YojK的表达情况。图4是pH对糖基转移酶YjiC和YojK酶活性的影响。图5是温度对糖基转移酶YjiC和YojK酶活性的影响。图6是金属离子对糖基转移酶YjiC和YojK酶活性的影响。图7是根据本专利技术的一个实施例生产人参皂苷Rh2的工艺流程图。图8是根据本专利技术描绘的人参皂苷Rh2的生产工艺流程图。图9是原人参二醇或人参皂苷Rh2经糖基转移酶YjiC或YojK的催化生产人参皂苷Rh2和人参皂苷F12的液相色谱图。图10是人参皂苷Rh2产物的质谱图。图11是人参皂苷F12产物的质谱图。图12是人参皂苷Rh2产物的核磁氢谱图。图13是人参皂苷Rh2产物的核磁碳谱图。图14是人参皂苷F12产物的核磁氢谱图。图15是人参皂苷F12产物的核磁碳谱图。具体实施方式本专利技术的一个实施例，参照图7，一种人参皂苷Rh2的生产方法，包括：（a）以原人参二醇为底物，以UDP-葡萄糖为糖基供体，利用糖基转移酶YjiC或YojK对原人参二醇的C3位羟基糖基化获得人参皂苷Rh2；（b）纯化以获得所述糖基化产物；（c）对纯化的糖基化产物进行结晶。参照图7，本专利技术的另一个实施例，原人参二醇的来源包括从人参中提取获得、水解人参皂苷获得、利用微生物细胞工厂生物合成获得或者这些方式组合获得。另外，糖基化反应所需糖基供体包括UDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖或其它核苷二磷酸葡萄糖的衍生物及其组合物。本专利技术的糖基转移酶编码基因YjiC和YojK来源于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis168）或其突变体的酶，所述糖基转移酶YjiC和YojK的核苷酸编码序列分别为SEQIDNo1和2,或者与SEQIDNo1或2所示核酸序列的同源性≧85%（较佳地95本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人参皂苷Rh2的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）以原人参二醇为底物，UDP‑葡萄糖为糖基供体，利用筛选获得的糖基转移酶YjiC或YojK对原人参二醇糖基化以获得人参皂苷Rh2；（b）纯化以获得所述糖基化产物；（c）对纯化的糖基化产物进行结晶。

【技术特征摘要】
1.一种人参皂苷Rh2的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）以原人参二醇为底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，利用筛选获得的糖基转移酶YjiC或YojK对原人参二醇糖基化以获得人参皂苷Rh2；（b）纯化以获得所述糖基化产物；（c）对纯化的糖基化产物进行结晶。2.根据权利要求1所述人参皂苷Rh2的生产方法，其中所述糖基转移酶YjiC和YojK的编码基因来源于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis168）或其突变体，所述糖基转移酶YjiC和YojK的核苷酸编码序列分别为SEQIDNo1和2,或者与SEQIDNo1或2所示核酸序列的同源性≧85%（较佳地95%）且编码的多肽产物对原人参二醇具有活性的核酸序列；所述糖基转移酶YjiC和YojK的多肽序列分别为SEQIDNo3和4，或者与SEQIDNo3或4的同源性≧85%（较佳地95%）且对原人参二醇具有活性的多肽序列。3.根据权利要求1所述的人参皂苷Rh2的生产方法，其中所述糖基转移酶是由转化或者整合了糖基转移酶基因YjiC或YojK的大肠杆菌（Escherichiacoli）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、毕赤酵母（Pichiapastoris）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）或黑曲霉（Aspergillusnigar）生产获得。4.根据权利要求3所述的人参皂苷Rh2的生产方法，其中所述糖基转移酶YjiC和YojK的生产菌株分别为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-YjiC和大...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙媛霞，戴隆海，朱玥明，曾艳，门燕，杨建刚，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12