一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒，属于免疫学检测领域。其包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；所述化学发光板的各孔包被有抗HE4抗体；所述试剂包括：HE4系列标准品溶液，HE4系列质控品，生物素标记抗HE4抗体，链酶亲和素‑HRP，样本稀释液，酶稀释液，化学发光溶液 A、B液，浓缩洗涤液；本发明专利技术的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测卵巢癌的辅助诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒及应用
本专利技术涉及一种检测人附睾蛋白4(HE4)的化学发光酶免疫检测试剂盒，用于检测卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的浓度，可用作监测卵巢癌的疾病状态、反映治疗疗效、早期发现、癌症复发情况，属于免疫学检测领域。技术背景卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，也是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤类型。卵巢癌高危人群包括：50岁以上的绝经女性；未婚或晚婚、不育或少育、不哺乳的女性；使用促排卵药物的不孕症者；有遗传性卵巢家族史的女性，有乳腺癌家族史者，有非息肉性结肠癌家族史者。卵巢癌通常表现为附件肿块，因临床症状不明显，容易造成漏诊与误诊。因此，超过70-75％的卵巢癌患者确诊时已处于癌症晚期，并已扩散到其他器官，错过了最佳治疗时机。目前，卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查。这种方法尽管应用较为普遍，但并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性；另一种方法是检测生物标志物CA125，但是CA125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。大约50％的卵巢癌I期患者并没有CA125水平升高的现象，也就是说有一半的卵巢癌患者可能被漏诊。人附睾蛋白4(humanepididymisgeneproduct4,HE4)为WFDC2基因的编码产物，是一种分泌蛋白，属于乳酸蛋白结构域家族蛋白，是很有诊断潜力的卵巢肿瘤标志物。正常生理情况下，HE4在人体中有非常低水平的表达，但在卵巢癌组织和患者血清中均高度表达，可用于卵巢癌的早期诊断、鉴别、治疗监测及预后评估。88％的卵巢癌患者都会出现HE4升高的现象。与CA125相比，HE4的灵敏度更高、特异性更强，尤其在疾病初期无症状表现阶段。HE4在良性肿瘤患者和正常人血清中含量极低，而在93％的卵巢浆液性癌及100％的卵巢子宫内膜样癌中呈阳性表达。HE4在鉴别卵巢肿瘤的良恶性质时灵敏度达到72.9％，明显优于CA125的43.3％((特异度为95％时)；单一HE4对I期卵巢癌诊断的灵敏度45.9％也明显优于单一CA125对I期15.1％(特异度为95％时)HE4与CA125是相互补充的标志物，两者联合应用，敏感性可增加到92％，能将假阴性结果减少30％，大大增加了卵巢癌诊断的准确性。CA125和HE4联合检测是卵巢癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期诊断的敏感性达到60.0％、77.80％、95.20％和100.00％.鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测HE4的方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人附睾蛋白4(HE4)的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒及应用。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点，用于检测卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的浓度。为实现上述目的，本专利技术利用了化学发光酶联免疫分析法，该方法是化学发光法和酶联免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。该方法采用了一步双抗体夹心法，主要原理是将包被抗体包被于微孔板中形成固相抗体，在包被后的微孔中加入标准品、质控品、样品，再加入生物素标记抗HE4抗体，再加入HRP-链酶亲和素反应后，弃上清洗涤，最终形成固相抗体—抗原—生物素标记抗HE4检测抗体—HRP-链酶亲和素复合物，加入发光液A液、B液，立刻读数获得RLU值。在整个反应过程中，样品中HE4含量越高，反应体系中发光强度越强RLU值越高；反之，样品中HE4含量越少，发光强度越弱RLU值越低。本专利技术提供了HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)测定方法及其检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂，包括：1.化学发光板。为白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板，各孔包被有抗HE4的抗体，抗体包被浓度为5.0μg/mL。2.HE4系列标准品溶液。浓度分别为：0、50、70、250、500、1800pmol/L。3.HE4系列质控品溶液。浓度分别为：250±80、70±14pmol/L。4.生物素标记抗HE4抗体。由抗HE4抗体与生物素偶合制成的偶联物作为检测抗体。5.辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素。6.化学发光溶液A、B液。A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。7.浓缩洗涤液。浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20(Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。本专利技术提供的HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的制备过程对本专利技术试剂盒检测的灵敏度以及相关性能影响很大，其制备关键步骤如下：1.预包被化学发光板的制备：采用将抗HE4抗体置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应2小时包被。采用的抗体包被浓度为5.0μg/mL，采用的是pH＝9.5的碳酸钠—碳酸氢钠缓冲溶液。微孔板中所包被的抗HE4抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板。包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，在37℃恒温箱中反应2小时封闭。2.HE4系列标准品溶液的制备：HE4抗原溶液浓度是决定本专利技术中HE4酶联免疫检测试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。将HE4抗原溶液可以用抗原稀释液稀释成1:1000的工作浓度，而后按照倍比稀释的方法稀释抗原至终浓度为0、50、70、250、500、1800pmol/L的系列标准品溶液。3.HE4系列质控溶液的制备：HE4质控溶液浓度是本专利技术中HE4酶联免疫检测试剂盒实验操作质控的重要因素。将HE4抗原纯品溶液用抗原稀释液稀释成1:1000的工作浓度，而后稀释至终浓度为250、70pmol/L的质控溶液。4.生物素标记抗HE4抗体的制备：10μl标记抗体加1μl溶解后的生物素，用标记液稀释至100μl，37℃水浴锅中反应1小时，而后转移至准备好的透析袋中，置于透析液中，置在磁力搅拌器上进行透析，透析液需4～6h更换一次，更换5次后即可收抗体。本专利技术提供的HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的内设以及制备过程中的试剂溶液对本专利技术试剂盒检测的灵敏度影响很大，所涉及相关溶液的配制方法如下：1.HE4标准品溶液：以既定方法将HE4抗原纯品用抗原稀释液配制成浓度分别为0、50、70、250、500、1800pmol/L的HE4系列标准溶液。2.HE4质控品溶液：以既定方法将HE4抗原纯品用抗原稀释液配制成浓度分别为250、70pmol/L的质控品溶液。3.生物素标记抗HE4抗体：按照既定方法将生物素与抗体进行偶联透析后获得的生物素标记抗HE4抗体，用抗体稀释液稀释成1:2000的工作浓度作为检测抗体。4.抗原稀释液：为含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有20gBSA，50g蔗糖，8gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4，1.44gNa2HPO4的水溶液。5.抗体稀释液：为含有蔗糖的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有50g蔗糖，8gNaCl，0.2gKCl，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒，包括盒体、设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂，其特征在于：化学发光板包被有抗HE4的抗体；试剂包括：HE4系列标准品溶液，HE4系列质控品溶液，样本稀释液，生物素标记抗HE4抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的链酶亲和素，酶稀释液，化学发光溶液A、B液，浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】
1.一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒，包括盒体、设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂，其特征在于：化学发光板包被有抗HE4的抗体；试剂包括：HE4系列标准品溶液，HE4系列质控品溶液，样本稀释液，生物素标记抗HE4抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的链酶亲和素，酶稀释液，化学发光溶液A、B液，浓缩洗涤液。2.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板，各孔包被有抗HE4的抗体，抗体包被浓度为5.0μg/mL。3.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：试剂盒的检测样本为人血清样本。4.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：HE4系列标准品溶液浓度分别为：0、50、70、250、500、1800pmol/L。5.根据权利要求4所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：HE4系列质控品溶液浓度分别为：250±80、70±14pmol/L。6.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：生物素标记抗HE4抗体由HE4抗体与生物素偶合制成，并作为检测抗体。7.根据权利要求5所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：浓缩洗涤液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH=7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。8.根据权利要求7所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：化学发光溶液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；化学发光溶液B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。9.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆上苏，孙旭，李孟，徐恒，陶艳茹，赵灿，
申请(专利权)人：南京健安医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32