一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用。典型地，本发明专利技术由化学发光底物液A液和B液两组分构成，其中所述A液包括鲁米诺(Luminol)，对咪唑苯酚，四苯基硼酸钠，二甲基甲酰胺(DMF)，磺丁基-β-环糊精，光稳定剂以及一定浓度的Tris缓冲液；所述B液包括：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，过氧化脲以及Tris缓冲液。本发明专利技术提供的化学发光底物液能够解决已有化学发光底物平台期短、稳定性较差，发光强度低，灵敏度低，本底偏高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、其制备方法及应用
本专利技术涉及用于化学发光免疫分析领域的组合物；具体而言，本专利技术涉及一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，所述底物液的制备方法及应用。
技术介绍
化学发光是指物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，可以分为直接发光和间接发光。两种物质发生化学反应生成新物质，反应释放的能量被新生成物质的分子吸收并跃迁至激发态，由激发态回到基态的过程中产生光辐射。多余的能量以光子的形式释放出来，这种现象称为化学发光。利用化学发光原理的化学发光免疫分析:(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光免疫分析技术已被广大研究人员所认可，正逐渐替代传统的生物检测技术。化学发光免疫分析按化学发光时间分类可分为闪光型(flashtype)和辉光型(glowtype)。闪光型发光时间很短，只有零点几秒到几秒。辉光型又称持续型，发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久。闪光型的样品必须立即测量，必须配以全自动化的加样及测量仪器。辉光型样品的测量可以使用通用型仪器，也可以配有全自动化仪器。目前，化学发光免疫分析涉及了医学临床诊断领域及生物科学各个领域。甚至，与生物学科有关的交叉领域，只要涉及到微量有机物质的含量测定，应用最为广泛的定量免疫检测方法主要是化学发光免疫分析(CLIA)。尤其是化学发光免疫分析的简便、快捷、灵敏、成本低廉，兼具放射免疫(RIA)灵敏度高和酶免疫(ELISA)便于操作、检测结果准确等优点，同时又克服了二者缺点。在生物和医学领域，应用化学发光免疫分析时，通过免疫结合酶标记物，使得含酶标记物的量直接反应了免疫结合效率，在标记抗体(抗原)、包被抗体(抗原)与底物均过量的条件下，使得待测物质的发光效率完全取决于发生结合反应之后的待测抗原(抗体)的浓度。其中化学发光的标记物主要以例如吖啶酯(AE)、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)为发展趋势。利用HRP标记的CLIA中，常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼,Luminol),或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼),其是一类重要的发光试剂。其结构如下所示：鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中与氧化剂(过氧化氢脲)使其进行化学反应，当其产物回到基态时发光,其波长为425nm。在已有的实践中，早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体),但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近年来，采用标记抗体进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物,鲁米诺的发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。鲁米诺发光较为迅速，但易于衰减，光信号持续时间短，造成检测结果的稳定性，重现性不佳。已有的研究已涉及了应用于鲁米诺发光的酶促化学发光及其底物组合物的研究。例如，文献1(CN1661370A)公开了一种酶促化学发光底物及配置方法，其涉及了A，B两组份的液体，包括了增强剂对碘苯酚等促进发光的组分；然而文献1使用对碘苯酚的增强发光组分，造成本底发光高；并且文献1也没有涉及发光灵敏度及发光强度的研究。此外，例如文献2(CN1687751A)也公开了一种高稳定性的增强化学发光底物，其中公开使用了对碘苯酚和四苯硼钠作为鲁米诺的增强剂组分，然而文献2中的化学发光底物，发光底物灵敏度不高，且发光强度响应速率较慢(从发光开始至发光强度最大值的时间间隔超过30分钟)。可见，现有技术存在已有的化学发光底物重复性、稳定性差，发光强度低，本底偏高，存在光氧化效应等问题，而这些问题一定程度上限制了化学发光免疫分析的实际应用。
技术实现思路
本专利技术基于以上问题及需求，提供一种稳定的HRP酶促化学发光底物液、配置方法及其应用，本专利技术提供的化学发光底物液能够解决已有化学发光底物平台期短、稳定性较差，发光强度低，灵敏度低，本底偏高的问题。根据本专利技术的第一方面，提供一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于，所述A液包括如下含量或浓度的组分：0.5-1.5g/L鲁米诺(Luminol)，0.5-2g/L对咪唑苯酚，0.15-0.5g/L四苯基硼酸钠，5-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，0.2-8g/L磺丁基-β-环糊精，0.2-4g/L光稳定剂，pH约7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括如下含量或浓度的组分：1-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.2-1g/L过氧化脲，pH约7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。根据本专利技术所提供的稳定的HRP酶促化学发光底物液，进一步优选地，所述A液包括组分的含量或浓度为：0.6-1.5g/L鲁米诺，1-2g/L对咪唑苯酚，0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，1-8g/L磺丁基-β-环糊精，0.2-4g/L光稳定剂，pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括组分的含量或浓度为：3-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.3-1g/L过氧化脲，pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。根据本专利技术进一步优选的实施方案中，所述A液包括组分的含量或浓度还可以为：0.6-0.8g/L鲁米诺，1-1.2g/L对咪唑苯酚，0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，4-8g/L磺丁基-β-环糊精，0.8-1.3g/L光稳定剂，pH8.5-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液还可以包括如下含量或浓度的组分：3-4g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.3-0.6g/L过氧化脲，pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。在本专利技术所提供的稳定的HRP酶促化学发光底物液中，所述的光稳定剂可优选受阻胺光稳定剂；当所述A液与所述B液混合后，所述化学发光底物液的pH值优选为8.5。在本专利技术提供的化学发光底物液中，HRP催化作用的较佳pH是中性或弱酸性,而专利技术人发现，鲁米诺化学发光反应的量子产率在pH为10左右时较高,若在酶的最佳条件下测定,检测的灵敏度会降低；反之，在碱性条件下HRP活性降低,使得催化能力减弱甚至丧失。本专利技术的化学发光底物液的双组份混合后pH为8.5，是灵敏度和发光量子产率综合较高的酸碱环境。本专利技术的化学发光底物液中的各个组分，可以在一个技术方案中组合使用，也可以在各个技术方案中分别选择或使用。本专利技术另一方面还提供了以上所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：所述A液的配制：(1)配置1L的pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液备用；(2)量取900ml上述Tris缓冲液，加入0.15-0.5g四苯基硼酸钠和0.2-8g磺丁基-β-环糊精，使其溶解；(3)分别称取0.5-1.5g鲁米诺，0.5-2g对咪唑苯酚，0.2-4g光稳定剂用5-30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解；(4)将步骤(3)的液体加入到步骤(2)的溶液中，充分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：所述A液包括如下含量或浓度的组分：0.5‑1.5g/L鲁米诺(Luminol)，0.5‑2g/L对咪唑苯酚，0.15‑0.5g/L四苯基硼酸钠，5‑30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，0.2‑8g/L磺丁基‑β‑环糊精，0.2‑4g/L光稳定剂，pH约7.0‑9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括如下含量或浓度的组分：1‑6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.2‑1g/L过氧化脲，pH约7.0‑9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：所述A液包括如下含量或浓度的组分：0.5-1.5g/L鲁米诺(Luminol)，0.5-2g/L对咪唑苯酚，0.15-0.5g/L四苯基硼酸钠，5-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，0.2-8g/L磺丁基-β-环糊精，0.2-4g/L光稳定剂，pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括如下含量或浓度的组分：1-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.2-1g/L过氧化脲，pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。2.如权利要求1所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液，其中，所述A液包括组分的含量或浓度为：0.6-1.5g/L鲁米诺，1-2g/L对咪唑苯酚，0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，1-8g/L磺丁基-β-环糊精，0.2-4g/L光稳定剂，pH7.0-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括组分的含量或浓度为：3-6g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.3-1g/L过氧化脲，pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。3.如权利要求1或2所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液，其中，所述A液包括组分的含量或浓度为：0.6-0.8g/L鲁米诺，1-1.2g/L对咪唑苯酚，0.2-0.5g/L四苯基硼酸钠，15-30ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，4-8g/L磺丁基-β-环糊精，0.8-1.3g/L光稳定剂，pH8.5-9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括如下含量或浓度的组分：3-4g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.3-0.6g/L过氧化脲，pH7.0-9.0的0.2mol/L的Tris缓冲液。4.权利要求1所述的稳定的HRP酶促化学发光底物液，其中，所述的光稳定剂为受阻胺光稳定剂；当所述A液与所述B液混合后，所述化学发光底物液的pH值为8.5。5.一种稳定的HRP酶促化学发光底物液，由A液和B液两组分构成，其特征在于：所述A液包括如下含量或浓度的组分：0.8g/L鲁米诺，1.2g/L对咪唑苯酚，0.2g/L四苯基硼酸钠，15ml/L二甲基甲酰胺(DMF)，4g/L磺丁基-β-环糊精，1g/L光稳定剂，pH9.0的0.25mol/L的Tris缓冲液；所述B液包括如下含量或浓度的组分：3g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.4g/L过氧化脲，pH7.0的0.2mol/L的T...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦军，谢元东，
申请(专利权)人：北京联众泰克科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11