本发明专利技术公开了检测NHP2基因第4号全外显子序列的方法、引物和试剂盒，包括扩增NHP2基因第4号全外显子的正、反向引物和一对测序引物。将Touch‑down PCR扩增和Sanger测序相结合，可快速检测先天性角化不良症患者体内NHP2基因第4号全外显子序列的突变情况，其中包含了位于4号全外显子上的主要突变位点V126M、Y139H、X154R。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测NHP2基因第4号全外显子序列突变的引物、方法和试剂盒。
技术介绍
先天性角化不良症(dskeratosis eongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NOP10，NHP2及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NOP10，NHP2，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。NHP2位于5q35.3位点负责编码端粒酶相关蛋白复合体组分蛋白的基因。NHP2蛋白是端粒酶相关蛋白复合体的核心蛋白之一，与dyskerin、NOP10、GAR1蛋白共同参与了真核生物核糖体的合成，前体mRNA剪接和端粒的维持。Vulliamy等在先天性角化不良症患者中发现NHP2存在突变，该突变缩短了端粒酶的长度，并降低了TERC的表达量水平。近年来，通过全基因组测序，发现NHP2基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。文献报道NHP2基因突变存在3个突变热点，集中在第4外显子中。突变热点V126M(G376A)，能引起该基因第126密码子缬氨酸到蛋氨酸的改变；突变热点Y139H(T415C)，能引起该基因第139密码子酪氨酸到组氨酸的改变；突变热点X154R(T460A)，该位点突变使终止密码子变成精氨酸，并使得氨基酸链的C端增长55个氨基酸。这些位点的变异能引起端粒酶RNA水平减低及端粒长度明显缩短，并降低了TERC的表达量水平。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行V126M、Y139H、X154R突变进行筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。本专利技术采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法检测NHP2基因第4号全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第4号全外显子序列，包括待检测的所有突变位点。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供检测NHP2基因第4号全外显子序列的引物，其特征在于，包括：扩增NHP2基因第4号全外显子序列的正、反向引物；其碱基序列为：NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGNHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG。进一步地，所述引物还包括一对测序引物，为通用引物M13，其碱基序列为M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：NHP2-F:NHP2-R＝1:1。进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：M13-F:M13-R＝1:1。进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。本专利技术的目的还在于提供一种检测NHP2基因第4号全外显子序列的方法，其包括如下步骤：(1)提取样本DNA；(2)利用一对扩增引物NHP2-F和NHP2-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；(3)利用一对测序引物M13-F和M13-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与NHP2基因野生型参考序列NHP2-ref进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGNHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTGM13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，步骤(2)中的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。本专利技术的目的还在于提供一种检测NHP2基因第4号全外显子序列突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增产物NHP2-F和NHP2-R，测序体系反应液包括一对测序引物M13-F和M13-R，其特征在于：NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGNHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTGM13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，所述试剂盒包括NHP2基因野生型参考序列NHP2-ref。进一步地，所述测序纯化液包括由虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I组成的测序纯化液。本专利技术的有益效果：本专利技术设计了扩增NHP2基因第4号全外显子序列的正，反向引物，构建了稳定的Touch-down PCR扩增体系，对整个第4号全外显子序列进行扩增，包含待检测的所有突变位点，同时在扩增时，富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用Sanger测序法，对PCR扩增产物进行测序反应扩增、纯化后变性、直接测序检测NHP2基因第4号全外显子序列中各突变位点的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。附图说明图1 NHP2基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测NHP2基因第4号全外显子序列的引物，其特征在于，包括：扩增NHP2基因第4号全外显子的正、反向引物；其碱基序列为：NHP2‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGNHP2‑R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG。
【技术特征摘要】
1.检测NHP2基因第4号全外显子序列的引物，其特征在于，包括：扩增NHP2基因第4号全外显子的正、反向引物；其碱基序列为：NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGNHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括一对测序引物，为通用引物M13，其碱基序列为：NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTNHP2-R：AACAGCTATGACCATG。3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为：NHP2-F:NHP2-R＝1:1。4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述一对测序引物的使用浓度比为：M13-F:M13-R＝1:1。5.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，...
【专利技术属性】
技术研发人员：单战，林有升，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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