一种检测JUMPY基因11号外显子突变的方法及探针技术

本发明专利技术提供了一种用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法，该方法将荧光定量PCR技术与TaqMan-MGB荧光探针技术相结合。本发明专利技术中还提供了用于检测的引物对、特异性探针以及阻断核酸。本发明专利技术中，采用荧光定量PCR方法，对失活突变区域序列进行特异性扩增检测，同时利用阻断核酸抑制样品中野生型DNA模板与引物探针的结合，实现突变的特异性扩增。本发明专利技术建立的检测方法简单有效，检测灵敏度高，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法。

【技术实现步骤摘要】
-种检测JUMPY基因11号外显子突变的方法及探针
本专利技术提供了一种用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法， 并提供了相关的扩增引物及探针，属于生物医学
。
技术介绍
hJUMPY(也称为 MTMR14, FLJ22405, Gene ID: 64419, C3orf29)基因是近几年通过 生物信息学方法，采用人类肌微管素蛋白序列作为诱饵筛选到的一个新基因。该基因位于3 号染色体上（3p25. 3)，由19个外显子组成，根据EST数据显示第17个外显子和第18个外 显子是可变的。预测该基因编码650aa的蛋白（accession no. AK074792)，并且与已知的肌 微管素的催化环高度同源。该预测的蛋白与果蝇中II号染色体上CG6542基因编码的卵衍 生的酪氨酸磷酸酶（egg-derived tyrosine phosphatase, EDTP)高度同源。更有趣的是， 在果蝇中，由于P-元件的插入导致了该基因的失活从而致使果蝇产生了 JUMPY表型：肌肉 功能缺陷、伴随颤抖以及运动缓慢的肌肉控制功能的逐渐消失。该基因名称也由此而来。 人类肌微管素蛋白（myotubularins)是一个大的家族。该家族在人类基因组中至 少有14个成员，分别命名为MTMl以及MTMR(myotubularin-related)l_13。其中9个成员 (MTMl、MTMRl、MTMR2、MTMR3、MTMR4、MTMR6、MTMR7、MTMR8 以及 MTMR14)拥有催化活性，可 以导致PI (3)P以及PI (3, 5)P2等底物的去磷酸化，其它的家族成员由于蛋白酪氨酸磷酸 酶位点上缺乏保守的半胱氨酸残基而不具备催化活性，因而并认为是死的磷酸酶。唯一 例外的是MTMR7,它最特异的底物是Ins(l，3)P2。在细胞内，MTM/MTMR主要调控细胞内的 PI⑶P以及PI (3, 5) P2,从而调控细胞内含物与膜转运，这是MTM/MTMR最重要，也是研究 最清楚的功能。然而，这些脂质磷酸酶也能调节许多其它的生物学过程，包括细胞增殖、分 化、坏死、细胞骨架以及细胞间隙及迁移等。许多磷酸酶都与人类遗传疾病相关，所以MTM 或者MTMR基因一旦突变会导致两种严重的功能紊乱和疾病：一种是X-偶联的肌管肌无力 XLMTM (X-1 inked myotubular myopathy)，另外一种是 CMT 疾病（Charcot-Marie-Tooth)， 主要表现为骨骼肌或者外周神经病变。所有有活性的蛋白酪氨酸磷酸酶/双特异性磷酸酶 (PTP/DSPs)(如PTP1B)以及磷脂酰肌醇磷酸酶（如PTEN)都含有保守的CX 5R序列。hJUMPY 也含有预测的PTP/DSPs结构域和进化上高度保守的CX5R序列，因而提示hJUMPY主要的 功能也是磷酸酶。的确，hJUMPY能水解一系列磷酸肌醇，其中最特异的底物是PI (3)P和 PI (3, 5)P2。hJUMPY在不同的组织中表达，而在骨骼肌组织中高表达，提示其可能参与骨骼 肌功能的调节。hJUMPY由于其结构与功能均与上述这些肌微管素蛋白及其相近，因而后来 也被命名为MTMR14。 2006年Jocelyn Laporte课题组报道，在人类中央核肌肉疾病患者中发现了该基 因的一个无义突变（11号外显子上的CGG突变为了 CAG，导致了 R336Q突变），因而进一步 提示hJUMPY与人类遗传病密切相关。后来，科研人员建立了该基因特异性敲除小鼠，也进 一步证实在小鼠中该基因的缺失也会导致骨骼肌肌肉疲劳和肌无力。近年研究也进一步揭 示了该基因与细胞自噬、心肌肥厚及机体代谢密切相关，提示该基因非常重要。因而，设计 出一套该基因突变的检测方法对于临床上遗传病的筛查也非常必要。 目前基因突变检测的方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线 检测法（High Resolution Melting Analysis, HRM)，突光定量PCR法等。其中最常见方法 为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比 较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方 法检测缺失突变效果较差。JUMPY基因11号外显子的无义突变发生在基因序列1007bp处， 其中CGG突变为CAG，导致其催化活性的急剧降低以及功能的紊乱（见表1)。因此，需要建 立一种快速有效的检测JUMPY基因11号外显子无义突变的方法。 表I JUMPY基因失活突变 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、合成检测所需的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如SEQ ID NO:1所示：5’‑CGGGCTGCTGGTACACTGTAT‑3’；所述下游引物的基因序列如SEQ ID NO:2所示：5’‑ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG‑3’；合成特异性探针，其基因序列如SEQ ID NO:3所示：5‘FAM‑TGGGATCGGACCCC‑MGB‑NFQ‑3’；(2)、合成阻断核酸，其基因序列如SEQ ID NO:4所示：5‘VIC‑TGGGATCAGACCC C‑MGB‑NFQ‑3’；(3)、对待检测样品进行处理并提取DNA；(4)、配制荧光定量PCR反应体系A，对待测样品上样量进行监测，利用引物对和特异性探针扩增待测样品，得到样品DNA的检测Ct值，作为样品的质控Ct值；(5)、配制荧光定量PCR反应体系B，对待测样品进行PCR扩增检测，利用阻断核酸抑制待测样品中存在的野生型DNA即未发生JUMPY基因11号外显子突变的DNA，利用引物对和特异性探针扩增待测样品中可能存在的JUMPY基因11号外显子无义突变DNA，得到样品DNA的突变检测Ct值；(6)、以质控Ct值作为上样量是否适当的标准，质控Ct值＜30则上样量合适，检测结果有效；30≤质控Ct值≤34则上样量偏低，可适当提高上样量后检测；以突变检测Ct值与质控Ct的差值△Ct值作为JUMPY基因11号外显子是否发生无义突变的判断标准，△Ct值≤6则样品存在突变，△Ct值＞6则样品无该突变或低于突变检测下限。...

【技术特征摘要】
1. 一种用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法，其特征在于包括 以下步骤： (1) 、合成检测所需的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如 SEQ ID N0:1 所示：5'-CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3'；所述下游引物的基因序列如 SEQ ID N0:2所示：5'-ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3';合成特异性探针，其基因序列如SEQIDN0:3 所示：5 'FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3' ； (2) 、合成阻断核酸，其基因序列如SEQ ID N0:4所示：5 'VIC-TGGGATCAGACCC C-MGB-NFQ-3,； (3) 、对待检测样品进行处理并提取DNA ; (4) 、配制荧光定量PCR反应体系A，对待测样品上样量进行监测，利用引物对和特异性 探针扩增待测样品，得到样品DNA的检测Ct值，作为样品的质控Ct值； (5) 、配制荧光定量PCR反应体系B，对待测样品进行PCR扩增检测，利用阻断核酸抑 制待测样品中存在的野生型DNA即未发生JUMPY基因11号外显子突变的DNA，利用引物对 和特异性探针扩增待测样品中可能存在的JUMPY基因11号外显子无义突变DNA，得到样品 DNA的突变检测Ct值； (6) 、以质控Ct值作为上样量是否适当的标准，质控Ct值< 30则上样量合适，检测结 果有效；30 <质控Ct值< 34则上样量偏低，可适当提高上样量后检测；以突变检测Ct值 与质控Ct的差值Λ Ct值作为JUMPY基因11号外显子是否发生无义突变的判断标准，Λ Ct 值< 6则样品存在突变，Λ Ct值> 6则样品无该突变或低于突变检测下限。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤⑷中所述的荧光定量PCR反应 体系A包括PCR缓冲液、上游引物、下游引物、特异性探针、Taq酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈金花，吕印，刘庆华，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42