检测TEX11基因第8、25号全外显子的方法和引物技术

本发明专利技术公开了检测TEX11基因第8、25号外显子的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括扩增覆盖TEX11基因第8、25号全外显子序列的2对正、反向引物和2对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述2对测序引物可用于快速检测无精子症患者的TEX11基因第8、25号全外显子序列的突变情况，其中包含了位于8号外显子上的主要突变位点M171V、25号外显子上的主要突变位点A698T。本发明专利技术所述引物和方法，检测准确、高效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测TEX11基因第8、25号全外显子突变的引物和方法。
技术介绍
无精子症(Azoospermia)是指多次精液检查(一般3次以上)均未发现精子者。临床上根据有无输精管道的梗阻，将无精子症分为两种：梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症。前者是指睾丸能够产生精子，但是输精管道阻塞，精子无法顺利排出。后者是指睾丸不能产生或者产生很少量的精子。非梗阻性无精子症的原因比较复杂，染色体异常是这种遗传疾病其原因之一。20％的非阻止性无精症男性都能检测到染色体不正常，包括X染色体不正常、结构畸变和Y染色体微缺失等无精症因素。TEX11是X染色体编码的精细胞特异蛋白，在睾丸精原细胞和精母细胞中有丰富的表达，与精子发生形成有很大的联系。目前已有研究指出，与Nijmegen断裂综合征中涉及的一种减数分裂双链破裂的减数分裂重组复合物11有蛋白质的相互作用。TEX11基因定位于染色体Xq13.1，含有34个外显子，编码1个104KDa的蛋白质分子，该蛋白除了一个介导蛋白质—蛋白质相互作用的TRP基序(tetratricopeptiderepeatmotif)外没有其他可以辨识的功能域。在偶线期和早期粗线期精母细胞中，TEX11焦点出现在联会复合体中，影响TEX11的同源重组。有研究指出，缺乏这种基因的雄性小鼠都不育，雌性小鼠低生育能力，且进一步研究分析表明，TEX11在雄性减数分裂中具有两个显著的功能：促进染色体的联会和交叉互换。并且TEX11与联会复合体中的SYCP2相互作用，表明TEX11在染色体联会和交叉形式中提供了一个物理连接的作用。TEX11在脊椎动物中是高度保守的。近来有文献报道，其在33名减数分裂阻滞患者体内发现5名存在TEX11基因突变，在193名混合睾丸萎缩患者中发现2名存在TEX11基因突变，提示TEX11的突变情况对无精子症有重要意义。多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于TEX11基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于TEX11基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对TEX11基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。本专利技术采用Sanger测序法检测TEX11基因第8、25号外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第8、25号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解TEX11基因第8、25号全外显子的基因突变情况，并不受TEX11基因的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
技术实现思路
本专利技术提供检测TEX11基因第8、25号外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测Azoospermia患者体内检测TEX11基因第8、25号外显子突变的情况。本专利技术的目的在于提供检测TEX11基因第8、25号外显子的引物，包括：扩增覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子突变的2对正、反向引物；其碱基序列为：TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'进一步地，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'进一步地，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：TEX11-511-F：TEX11-511-R＝1：1；TEX11-2092-F：TEX11-2092-R＝1：1。进一步地，所述2对测序引物的使用浓度比为：TEX11S-511-F：TEX11S-511-R＝1：1；TEX11S-2092-F：TEX11S-2092-R＝1：1。本专利技术的目的还在于提供一种检测TEX11基因第8、25号外显子的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用2对扩增引物TEX11-511-F与TEX11-511-R，TEX11-2092-F与TEX11-2092-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子突变的扩增产物；(3)利用2对测序引物TEX11S-511-F与TEX11S-511-R，TEX11S-2092-F与TEX11S-2092-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型TEX11基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'本专利技术的目的还在于提供一种检测TEX11基因第8、25号外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括2对扩增引物TEX11-511-F与TEX11-511-R，TEX11-2092-F与TEX11-2092-R，测序体系包括2对测序引物TEX11S-511-F与TEX11S-511-R，TEX11S-2092-F与TEX11S-2092-R，包括：TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'TEX11-511-R：5'ATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测TEX11基因第8、25号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测TEX11基因第8、25号全外显子的正、反向引物。其碱基序列为：TEX11‑511‑F：5' CCTTAGCCACCCCATAGA 3'TEX11‑511‑R：5' ATGCTAACTGTTGCTTTT 3'TEX11‑2092‑F：5' ATCAGGGAAGGCAAACAT 3'TEX11‑2092‑R：5' AGAAATACAAGGGCGAAT 3'

【技术特征摘要】
1.检测TEX11基因第8、25号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测TEX11基
因第8、25号全外显子的正、反向引物。其碱基序列为：
TEX11-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列
为：
TEX11S-511-F：5'CCTTAGCCACCCCATAGA3'
TEX11S-511-R：5'ATGCTAACTGTTGCTTTT3'
TEX11S-2092-F：5'ATCAGGGAAGGCAAACAT3'
TEX11S-2092-R：5'AGAAATACAAGGGCGAAT3'
3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对正、反向引物的使用浓度比
为：TEX11-511-F：TEX11-511-R＝1：1；TEX11-2092-F：TEX11-2092-R＝1：1。
4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对测序引物的使用浓度比为：
TEX11S-511-F：TEX11S-511-R＝1：1；TEX11S-2092-F：TEX11S-2092-R＝1：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赵玲，林筱剑，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33