缺失突变的chiB启动子及其组成型表达蛋白的应用制造技术

一种缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子及其组成型表达蛋白的应用。本发明专利技术首先提供了一种DNA定向分子育种方法，经所述的方法进行DNA操作后获得的缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子序列——chiBp△135，如序列表SEQ?ID?No.1所示。所述的启动子序列，可以使与其相连接的目的基因的核苷酸序列以组成型方式表达。可以利用这一突变的启动子在苏云金芽胞杆菌或大肠杆菌细胞中组成型、大量表达目的蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别是一种经过基因操作产生的苏云金芽胞杆菌几丁质酶编码基因ChiB突变的启动子序列及其应用。具体地描述，从苏云金芽胞杆菌总DNA中克隆出这一几丁质酶启动子序列，经过在其分子的5'-端和3'-端缺失部分碱基序列后，获得比原野生型启动子缩短的序列，该序列称为“chiBp A 135”，将其与不同的表达载体连接，转化不同的苏云金芽胞杆菌，使该转基因细胞组成型表达其下游几丁质酶或其他目的基因的方法和应用。
技术介绍
几丁质是含量仅次于纤维素的生物高分子物质，广泛存在于自然界中。几丁质酶(EC3. 2. I. 14)能特异性水解几丁质，将几丁质降解成几丁单糖以及几丁二糖[(G1cNAc)2]、几丁三糖[(GlcNAc)3]等分子大小不同的几丁寡糖[(GlcNAc)n]。I、几丁质酶在农业方面具有巨大的应用前景，为控制植物病虫害提供了很好的选择。绝大多数植物病原真菌细胞壁都含有大量的几丁质。不少体外抑菌研究证明，几丁质酶能抑制病原真菌孢子的萌发和菌丝的生长{Hoondal，2005#1941 ;ffang, 2002#1965}。因此几丁质酶一直被认为是植物抗真菌病害的潜在物质。许多研究已经将细菌和植物几丁质酶基因转移到大豆、马铃薯、烟草、莴苣、番茄、葡萄及甜菜等植物中，获得了表达几丁质酶活性的转基因植物。Zhang等{Zhang，2011#2043}在催化植物生长根基细菌的基因组中整合枯草芽胞杆菌几丁质酶基因用于提高植物抗病原真菌的能力。这些植物与非转基因植物相比，它们不仅能抗真菌，而且对线虫、昆虫和其它一些病原生物也有一定的抗性。最近，Nature报道了脂质几丁寡糖可作为信号分子刺激植物内生真菌菌丝和菌根的形成，进而促进植物根部发育[3]，这是几丁寡糖在农业应用方面的最新发现。由于几丁质是昆虫甲壳及中肠围食膜的重要组成成分，几丁质酶破坏昆虫这些结构后，可以加速害虫罹病进程，提高死亡率。白僵菌素是著名的生物杀虫毒素，Fan等{Fan, 2007#1976}通过在蚕白僵菌中联合表达外源几丁质酶来提高其杀虫活力。另外研究发现几丁质酶可以杀死或阻止发育阶段中的蚊子幼虫，由此可以设想利用几丁质酶来控制蚊子和由蚊子传播的疾病，而不需使用农药{Dahiya，2006#260}。2、几丁质酶在工业上也具有重要的经济价值。它能提高很多有价值产品的产量。鉴于几丁质衍生物具有重要的药物价值，几丁质酶也用于生产几丁寡聚体、氨基葡萄糖和几丁单体。如，Hayes等{Hayes, 2008#2331}利用几丁质酶从贝类废弃物中生产具有药用价值的壳聚糖；Wang等{Wang，2006#210}利用枯草芽胞杆菌的几丁质酶从贝类废弃物中获取能抑制癌细胞增生的几丁寡聚体;Makino等{Makino，2006#2336}利用芽胞杆菌和沙门氏菌的几丁质酶获得几丁寡聚体。几丁质酶也可直接用于人类卫生保健，例如几丁质酶用于生产眼药，可以作为抗真菌类护肤品的添加剂{Dahiya，2006#260}。在贝类加工中，固体废弃物的主要成份是几丁质、碳酸钙和蛋白。因此可以利用产几丁质酶的真菌生产酵母单细胞蛋白(SCP)。Cody等{Cody，1990#1940}报道曾试图使用几丁质酶将几丁质转变为乙醇。3、几丁质酶在科学研究中也有重要应用。几丁质和壳聚糖是广泛存在于真菌细胞壁的多聚分子。利用几丁质酶和其它技术的结合可以定位真菌及植物细胞壁中的几丁质。Grenier等{Grenier, 1991#1939}利用大麦几丁质酶和胶体金颗粒来定位真菌菌丝及孢子中的壳聚糖。真菌原生质体是研究细胞壁合成、酶的合成、分泌以及生物技术应用的良好实验材料。而几丁质是真菌细胞壁的组成成份，利用几丁质酶和其它细胞壁降解酶能有效的得到真菌原生质体。Hoondal等{Hoondal, 2005#1941}利用肠杆菌(Enterobacter)的几丁质酶，有效的得到了瑞氏木霉(Trichoderma reesei),佛罗里达侧耳(Pleurotus fIorida)和双孢燕(Agaricus bisporus)等真菌的原生质体。4、高分子量的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞，增强机体免疫力，已用于抗癌的临床治疗以及药物和保健食品的开发领域[4~6]。 5、在细菌细胞中，有的酶无需诱导便可以表达，称为组成型表达酶。而细菌几丁质酶属于诱导型表达酶，几丁质酶基因的表达是受本身代谢机制控制，如果环境中没有几丁质存在，细胞中的调控机制会关闭这一相关基因。所以，如果细菌细胞可以组成型表达酶，便可以利用普通细菌培养基，使制备酶的方法即简便又经济。虽然目前已从多种芽胞杆菌内克隆到几丁质酶编码基因(chi)，产几丁质酶菌株的酶活性不是很高，且需要诱导培养，这些都制约着几丁质酶的微生物发酵生产技术。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是克服现有育种技术所存在的效率低且工作量大的不足，提供一种缺失突变的几丁质酶编码基因ChiB启动子及其组成型表达蛋白的应用。若采用传统的育种技术获得组成型表达的基因启动子，主要利用化学及物理诱变剂处理细胞的全部DNA，诱变方法是随机改变细菌全基因组的DNA分子，且DNA的突变频率极低，所以需要大量的诱变及筛选，工作量极大，诱变周期很长。而本专利技术提供了定向分子操作的方法。所利用的科学原理是，细胞中存在一类负调控基因表达的蛋白，称为阻遏蛋白，该蛋白特异地结合在所调控基因的启动子负控制元件序列上，该序列通常称为操纵子区域。若将操纵子区域删除，则阻遏蛋白失去结合位点，也就失去了负调控基因表达的功能，此时该基因便可以组成型表达。这种定向分子操作的方法只需要很短的时间便可以完成。本专利技术的目的之二是，利用组成型表达启动子，在以获得几丁质酶为目的的细菌培养过程中不必再添加几丁质作为诱导物，可以简化方法，节约成本，获得更高的酶活性。本专利技术涉及了缺失的几丁质酶B基因(ChiB)启动子，可以在无诱导物存在的培养条件下，提高同源及异源几丁质酶或其他目的蛋白的表达水平。所述的缺失启动子的这一功能是完全无预期的发现，在利用缺失方法研究chiB启动子功能时，获得所述的缺失启动子，将该片段连接几丁质酶基因后，酶的合成量明显提高，而且不需要几丁质诱导，可以组成型表达。在实施例中，描述了这一缺失启动子的分子改造方法及其序列。在另一实施例中，提供了利用所述的缺失启动子片段构建组成型表达载体的方法，该载体的宿主可以是大肠杆菌(E. coli)或苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)。在随后的2个实施例中，描述了如何不需诱导培养细菌，获得来自其他细菌的异源￠-半乳糖苷酶。在最后一个实施例中，组成型表达的目的蛋白，是来自地衣芽胞杆菌的几丁质酶ChiMY和来自Bt的另一几丁质酶ChiA。本专利技术提供了缺失启动子片段的获得方法，还提供了利用该启动子在大肠杆菌(E. coli)或苏云金芽胞杆菌(Bt)中不需诱导制备几丁质酶的方法，所述的几丁质酶可以是Bt本身的，也可以是来自其他芽胞杆菌的。本专利技术首先提供了一种分子定向育种方法，该方法使几丁质酶编码基因chiB启动子序列缩短，防止了阻遏蛋白对基因表达的抑制；所述的序列缩短的方法是将原启动子序列中负控本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子定向育种方法，该方法使几丁质酶编码基因chiB启动子序列缩短，防止了阻遏蛋白对基因表达的抑制；所述的序列缩短的方法是:将原启动子序列中负控制元件上游作为PCR扩增的一端起始点，这样获得的扩增产物则是缺失了包括负控制元件序列在内的缺失启动子序列。

【技术特征摘要】
1.ー种分子定向育种方法，该方法使几丁质酶编码基因ChiB启动子序列缩短，防止了阻遏蛋白对基因表达的抑制；所述的序列缩短的方法是将原启动子序列中负控制元件上游作为PCR扩增的一端起始点，这样获得的扩增产物则是缺失了包括负控制元件序列在内的缺失启动子序列。2.一种经权利要求I所述的方法获得的缺失突变的几丁质酶编码基因chi...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈月华，罗洋，谢池楚，李蓬飞，蔡峻，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：