用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组及应用，本发明专利技术成功筛选并合成15对荧光标记微卫星引物组，该引物组可以用于建立斑海豹亲子鉴定技术，并且公开了所使用的亲子鉴定的试剂盒。本发明专利技术所述鉴定方法具有准确、高效、可靠等特点，可以指导斑海豹的人工繁育和野外放流工作，并在斑海豹家系管理和种质鉴定进行推广应用。

【技术实现步骤摘要】
用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组及其应用
本专利技术属于海洋哺乳动物亲子鉴定
，具体涉及用于斑海豹亲子鉴定的SSR引物组及应用。
技术介绍
斑海豹(Phocalargha)属食肉目(Carnivora)犬形亚目(Caniformia)海豹科(Phocidae)、斑海豹属(Phoca)，是我国二级保护动物，主要分布于北太平洋的北部和西部海域及其沿岸和岛屿，在我国主要分布于渤海和黄海，偶见于南海。斑海豹是唯一能在我国海域进行繁殖的鳍足类动物，而渤海辽东湾结冰区是斑海豹8个繁殖区中最南的一个。斑海豹野外种群正在遭受威胁，人工繁殖成为保护该物种的重要手段，以大连圣亚旅游控股股份有限公司(以下简称“大连圣亚”)为例，自开展斑海豹人工繁殖工作以来，共成功繁育斑海豹44头，现每年有8～10头个体在人工条件下出生，到目前为止F1代个体已占整个饲养群体的60％，许多F1代已达性成熟。随着时间增长，诸多的F1代将会不可避免参与繁殖，遗憾的是这些F1代的父权关系尚不明确，类似的情况也在其他有斑海豹的水族馆存在。亲权鉴定又称亲子鉴定，微卫星亲子鉴定是近年来流行的一种亲子鉴定技术，其在人类法医鉴定、重要经济动物和濒危动物的遗传谱系鉴定中得到了广泛应用。然而，目前该技术在海洋哺乳动物中仅见于瓶鼻海豚(Tursiopsspp)、长江江豚(Neophocaenaasiaeorientalisasiaeorientalis)等少数鲸类动物。近年来，斑海豹等海豹科物种的基因组、转录组序列的挖掘工作取得了一些突破，从而给该物种微卫星亲子鉴定技术的研发和应用提供了契机。目前，还没有将微卫星分子标记应用到斑海豹的亲子鉴定和遗传管理的报道。本专利技术旨在利用专利技术的微卫星引物组，采用荧光标记毛细管电泳技术建立斑海豹亲子鉴定技术，为斑海豹繁殖群体遗传谱系的构建、各水族馆间斑海豹的交换、交流提供依据，以期合理的指导斑海豹人工繁殖。
技术实现思路
本专利技术旨在提供用于斑海豹亲子鉴定的SSR标记引物组，该引物可用于斑海豹亲子鉴定，含有15对引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.30所示。本专利技术的另一个目的在于提供了用于斑海豹亲子鉴定的SSR荧光标记引物组的应用。包括利用该引物组制备成用于斑海豹亲子鉴定的试剂盒，或利用该引物组对斑海豹进行亲子鉴定，或利用其进行家系管理。所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.30所示的全部/部分引物组，以及10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、ExTaqDNA聚合酶和双蒸水。本专利技术还公开一种斑海豹亲子鉴定的方法，其包括以下操作步骤：提取待鉴定亲本及子代样品DNA，对上文所述的引物组的正向引物，标记FAM、HEX、TAM或ROX的荧光染料；再利用标记荧光染料后的全部/部分引物组对提取的样品DNA进行扩增，进行毛细管电泳，依据电泳峰图结果进行基因分型，应用GeneMapper软件进行基因分型，将分析结果输出在Excel表格中。使用Cervus软件统计等位基因数(Na)、平均期望值杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、累积第一排除率(CE-1P)、累积第二排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)，根据Parentage模块计算出来的LOD的值以及Delta值标准，结果显示为“+”(即80％的置信度水平下)为其可能亲本；结果显示为“*”(即95％的置信度水平下)为其最可能亲本。具体的，本专利技术实施例3中列举了亲子关系判定方法，有力证明了本专利技术提供的SSR分子标记引物组，可用于斑海豹家系管理和种质鉴定，从而合理预期，本专利技术所述的SSR分子标记引物组及其应用方法，能够有效指导斑海豹的人工繁殖，保护我国斑海豹的遗传多样性和种质资源。附图说明本专利技术附图15幅，为专利技术的引物组在亲子鉴定中的部分测序图，显示了设计引物的正确性，分别是：图1为引物PLMS10测序图，从左至右依次为母本59368(275bp,278bp)，子代87492(278bp)，父本59347(275bp,278bp)。图2为引物PLMS12测序图，从左至右依次为母本59368(280bp)，子代87492(277bp,280bp)，父本59347(277bp)。图3为引物PLMS17测序图，从左至右依次为母本59368(261bp)，子代87492(258bp,261bp)，父本59347(258bp,261bp)。图4为引物PLMS24测序图，从左至右依次为母本59368(223bp)，子代87492(223bp)，父本59347(223bp)。图5为引物PLMS28测序图，从左至右依次为母本59368(263bp)，子代87492(263bp)，父本59347(263bp)。图6为引物PLMS44测序图，从左至右依次为母本59368(226bp)，子代87492(226bp)，父本59347(226bp)。图7为引物PLMS45测序图，从左至右依次为母本59368(189bp)，子代87492(189bp)，父本59347(189bp)。图8为引物PLMS68测序图，从左至右依次为母本59368(250bp,258bp)，子代87492(250bp,258bp)，父本59347(247bp,258bp)。图9为引物PLMS55测序图，从左至右依次为母本59368(211bp,223bp)，子代87492(211bp)，父本59347(211bp)。图10为引物PLMS58测序图，从左至右依次为母本59368(231bp)，子代87492(231bp)，父本59347(231bp)。图11为引物PLMS71测序图，从左至右依次为母本59368(248bp)，子代87492(248bp,295bp)，父本59347(248bp,295bp)。图12为引物PLMS76测序图，从左至右依次为母本59368(264bp,280bp)，子代87492(264bp,280bp)，父本59347(280bp)。图13为引物PLMS79测序图，从左至右依次为母本59368(314bp,318bp)，子代87492(314bp,316bp)，父本59347(316bp)。图14为引物PLMS83测序图，从左至右依次为母本59368(217bp)，子代87492(217bp)，父本59347(217bp)。图15为引物PLMS90测序图，从左至右依次为母本59368(287bp)，子代87492(287bp)，父本59347(287bp)。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。样品采集：专利技术申请人于2014年至2016年对大连圣亚豢养的53头斑海豹进行血样的采集工作，其中10头待鉴定的海豹幼仔的母子关系都有记录均为已知，候选待鉴定父本17头。本专利技术在斑海豹体检时，由兽医或训练员用一次性注射器从尾部静脉血管采取约5ml血液，装于医用血常规管中(EDTA-K2抗凝)，4℃保存，带回实验室后长期保存于-20℃。DNA提取采用天根公司的血液基因组DNA提纯试剂盒，具体步骤参考操作手册。实施例1斑海豹亲子鉴定微卫星标记的引物组筛选及荧光标记引物组在斑海豹亲子鉴定中的应用，包括如下步骤：(一)引物组筛选由本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于斑海豹亲子鉴定的SSR引物组，含有15对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示。

【技术特征摘要】
1.用于斑海豹亲子鉴定的SSR引物组，含有15对引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.30所示。2.权利要求1所述引物组在斑海豹亲子鉴定中的应用。3.权利要求1所述引物组在制备斑海豹亲子鉴定试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒包含权利要求1所述全部/部分引物组、10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、ExTaqDNA聚合酶和双蒸水。5.斑海豹亲子鉴定的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：提取待鉴定亲本及子代样品DNA；对权利要求1所述的引物组的正向引物，标记F...

【专利技术属性】
技术研发人员：高祥刚，鹿志创，田甲申，宋新然，韩家波，赫崇波，王建科，李洋，张胜久，李艳秋，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，大连圣亚旅游控股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21