鸡白血病内源病毒ev21分子标记及其引物、鉴定方法、应用技术

本发明专利技术涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡白血病内源病毒ev21分子标记及其引物，该引物的正向引物为：5’GGAGGGAGACTATTTTTACACG3’；反向引物为：5’GTTTAACGGACCAACAGGCTAGTCTCTCG’。该引物特异性好，扩增效率高，扩增产物中包含6614bp的ev21基因序列。本发明专利技术还提供了一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，该方法与上述引物配合进行实验，操作简便，可行性高，利用该方法还可以用于快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化或某些品种鸡的快慢羽表型鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡白血病内源病毒ev21分子标记及其引物、鉴定方法、应用。
技术介绍
禽白血病病毒(Avianleukosisviruses，ALVs)是引起禽类各种造血细胞肿瘤性增生的一类逆转录酶病毒。针对鸡的ALVs共有六种亚型(A、B、C、D、E和J)。E型白血病病毒(ALVE)属鸡内源性病毒(endogenousvirus，EV)，其完整的或部分的遗传序列元件整合于鸡细胞染色体基因组中，随鸡基因组复制而复制，遵循孟德尔遗传规律，具备潜在的影响鸡体生理功能的作用。ev21是ALVE的一种，其转录活化影响外源病毒的感染和疾病发生，并影响蛋品生产、蛋重和蛋比重等重要经济性状。现已证明鸡携带有超过50种不同的ALVE内源病毒位点，其中22种ALVE位点来自于白莱航鸡体内。每只蛋鸡一般携带有1～3个ALVE位点，而每只肉鸡有8～10个。之前的研究认为，ev21基因与慢羽鸡K基因连锁(Smith&Crittenden1986；Baconetal.1988)，慢羽鸡和快羽鸡的杂交实验发现ev21与K基因间距0.3cM(Smith&Fadly1994)。慢羽白莱航鸡及其后代均表现出对外源淋巴白血病病毒免疫性能减退、生产性能下降、死亡率升高等(Harrisetat，1984；SmithandFadly，1988)，这些症状可能都与ev21相关。宁中华等也证实了白壳蛋鸡慢羽系的ALV高发生率与内源病毒ev21的存在有直接关系，并对蛋鸡的生产性能产生影响。九十年代研究者利用Southern-blot技术来检测，即通过制备病毒特异DNA片断及其侧翼区域的特异探针利用DNA杂交和RFLP技术检测ALVE病毒元件，该技术基于病毒插入位点上下游的鸡基因组序列特异性通过限制内切酶获得不同长度基因片断而鉴定的。由于Southern-blot技术成本较高，且费时，现在一般应用基于位点特异性的PCR技术鉴别。之前也有研究通过PCR获得390bp或515bp序列以鉴定ev21的存在，但由于ev21基因序列全长为7524bp，扩增难度很大，因而只有相对小的测序序列被成功扩增，未见有获得较完整病毒基因组序列的报道，这对于ev21的研究带来很多的阻碍。此外，由于之前的扩增均只扩增出了ev21的一小部分，而ev21具有重复序列，且其插入区和LTR具有多态性，因而关于其基因序列与慢羽鸡K基因连锁的报道可能存在错误。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，该标记中含有ev21基因中的6614bp序列，占ev21基因全长的88％左右，用此标记可检测鸡体内是否携带ev21基因。本专利技术的第二目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定引物，该引物特异性好，扩增效率高，可用于白莱航鸡快慢羽表型的分子鉴定。本专利技术的第三目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，该方法可以扩增出如上所述的分子标记。本专利技术的第四目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化中的应用，配合本申请特定的引物及其扩展方法。该方法比其他的现有的PCR技术鉴定结果都更为准确，可排除快慢羽种鸡白血病病毒ev21携带者，建立用于羽速性别鉴定的慢羽纯种蛋鸡品系，对蛋鸡品种选育生产具有重大意义。本专利技术的第五目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽表型鉴定中的应用。一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，其碱基序列为SEQIDNO:1所示。如上所述ev21的分子标记的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。通常说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。一般引物序列中G+C含量一般为40％～60％，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。本专利技术所述引物SEQIDNO:2中G+C含量为45.5％，SEQIDNO:3中G+C含量为51.7％，且碱基分布随机，因而具有适中的解链温度，便于扩增。所述引物自身不存在互补序列(连续互补碱基小于3bp)；引物3’端无修饰不易错配；最终扩增产物长度为7590bp，其中包含6614bp的ev21基因序列及部分鸡的基因序列。综上，该引物特异性好，扩增效率高，可很好的用于鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定。一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，包括：提取待检样本的DNA作为模板，用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示引物对所述DNA进行PCR扩增并将得到的扩增产物SEQIDNO:1进行电泳分析。优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，所述PCR扩增反应体系为：其中，所用LATaq，dNTP等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；LATaq商品名为TaKaRaLA，产品货号为RR52A。进一步优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法：所述正向引物和反向引物的浓度为8～12μM；所述DNA模板浓度为50～150ng/ul。本专利技术涉及同一体系或配比中各组分的量，应视为对相关各组分之间比例关系的限定，而不是对各自用量绝对值的限定，各组分之间的比例关系可适当改变。优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，所述PCR扩增反应体系的相应反应程序为:本申请采用两步法，退火延伸合为一步。随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTPs等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本专利技术限定为30～35个循环。优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，所述电泳为琼脂糖浓度为0.8～1％的琼脂糖凝胶电泳；电泳的电压为130～150V恒压，电泳时间为20～25分钟。优选的，在进行所述电泳分析时，对结果的分析方法为：若样本的DNA能扩增出7590bp的目的片段，则该样本对应的鸡体内携带ev21基因。如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化中的应用。内源性病毒指动物细胞不是因外源性感染而是在染色体组上原本保持着的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，其碱基序列为SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，其碱基序列为SEQ
IDNO:1所示。
2.权利要求1所述ev21的分子标记的分子鉴定引物，其碱基
序列分别为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。
3.一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于，
包括：
提取待检样本的DNA作为模板，用SEQIDNO:2和SEQID
NO:3所示引物对所述DNA进行PCR扩增并将得到的扩增产物
SEQIDNO:1进行电泳分析。
4.如权利要求3所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方
法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
5.如权利要求4所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方
法，其特征在于：
所述正向引物和反向引物的浓度为8～12μM；
所述DNA模板浓度为50～150ng/ul。
6.如权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兰会，张秀玲，李祥龙，张乐超，刘春杨，臧素敏，周荣艳，
申请(专利权)人：河北农业大学，河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北;13