本发明专利技术属于分子标记技术开发及应用领域，具体提供基于转录组序列开发李SSR标记引物对及其在李种质资源研究中的应用。所述引物对是基于转录组序列开发得到的，在转录组测序的基础上，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR位点搜索和SSR引物设计，可以大批量开发SSR标记，大大提高了开发的效率，克服了传统方式开发SSR标记，步骤复杂、工作量大、开发成本高的问题。最终进行SSR引物筛选与多样性分析，验证了SSR引物的有效性。本发明专利技术为李SSR标记引物的开发及利用SSR分子标记进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子标记技术开发及应用领域，具体涉及基于转录组序列开发的李SSR标记引物对及SSR引物开发的方法。
技术介绍
李是蔷薇科李属植物，广泛分布于世界各国，也是我国重要的传统果树之一。李果 实富含类胡萝卜素、维生素和花色苷等生物活性物质，具有预防多种疾病的功效，深受消费 者喜爱。我国李种质资源极其丰富，李品种数量繁多，命名不科学，同名异物或同物异名的 现象十分严重，严重阻碍了李种质资源的开发利用。因此，通过系统的研究，完善品种资源 分类，对李种质资源的收集、保存和利用具有十分重要的意义。 分子标记技术是鉴定果树种质资源的有效途径，并且已成功地应用于李种质资源 研究。SSR标记具有共显性、数量丰富、多态性高、重复性好、易检测、操作简单等优点，已被 广泛用于包括李在内的多种的果树品种鉴定、遗传多样性分析，遗传图谱构建和亲缘关系 研究等领域。李缺乏基因组信息，采用传统方式进行SSR标记的开发，步骤复杂、工作量大、 开发成本高，限制了SSR标记技术在李种质资源研究中的应用。EST-SSR来源于转录区域， 可直接反映相关基因的多样性，具有良好的通用性。近年来，高通量测序技术的快速发展使 果树EST-SSR的开发得到了广泛的应用。本研究以芙蓉李转录组数据为基础，开发SSR引 物，为利用SSR分子标记进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前缺乏李SSR标记引物的不足，提供基于转录组序列开发 的李SSR标记引物及应用。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：基于转录组序列开发的李SSR标记 引物对，其特征在于：在检测过程中使用一对或多对引物，所述引物共40对引物，分别为： 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20所示； 第一对引物，其序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO: 23和SEQIDNO: 24所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO: 33和SEQIDNO: 34所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO: 53和SEQIDNO: 54所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:57和SEQIDNO:58所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:59和SEQIDNO:60所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:61和SEQIDNO:62所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:63和SEQIDNO:64所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:65和SEQIDNO:66所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:67和SEQIDNO:68所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:71和SEQIDNO:72所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO: 73和SEQIDNO: 74所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:75和SEQIDNO:76所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:77和SEQIDNO:78所示； 第一对引物，其序列如SEQIDNO:79和SEQIDNO:80所示； 进一步的所述的引物对通过以下步骤得到： 1)构建转录组文库：提取李植物组织总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。随后，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；以mRNA为模板，用六碱基 随机引物（randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseΗ和DNA polymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA;纯化的双链cDNA再 进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；最后 通过PCR富集得到cDNA文库。 2)对上述转录组文库进行测序，采用Trinity法对其进行序列组装，得到转录组 序列，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，并对Unigene序列进行生物信息学分析； 3)采用MISA软件对李转录组中长度大于lkb的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基 重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位 点搜索。 4)采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-27bp，预计扩增产物长 度100-280bp，GC含量40% -60%，退火温度57-63°C，上、下游引物的退火温度值相差不大 于 2。。。 5)SSR引物筛选与多样性分析 提取李种质资源材料DNA，进行设计引物有效性的PCR鉴定，筛选SSR引物，若有与预计 扩增产物长度相近的扩增产物，该引物即为有效引物。采用筛选出的有效引物进行李种质 资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等。PCR反应体系为 20μL，：2XDreamtaqgreenPCRmastermix(Thermo scientific) 10yL，上、下游引物各 0.8yL(浓度为 10μL?οΙ本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于转录组序列开发的李SSR标记引物对，其特征在于：在检测过程中使用一对或多对引物，所述引物共40对引物，分别为：第一对引物，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78所示；第一对引物，其序列如SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80所示。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方智振，叶新福，周丹蓉，姜翠翠，潘少霖，
申请(专利权)人：福建省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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