两条单标记引物检测技术及试剂盒制造技术

两条单标记引物检测技术及试剂盒，属于生物技术领域，包括有两条引物，分别标记了报告基团和猝灭基团，用于检测乙型肝炎病毒。本发明专利技术可以明显降低荧光PCR方法的成本，同时保持荧光PCR灵敏、特异的特征。

【技术实现步骤摘要】
两条单标记引物检测技术及试剂盒
本专利技术涉及一种采用两条分别标记报告基团和猝灭基团的引物进行核酸扩增PCR检测的方法及试剂盒。
技术介绍
近年来，核酸扩增技术特别是聚合酶链反应(PCR)在实验检测和临床诊断中迅速发展，特别是实时荧光PCR技术，可以采用自动化仪器进行扩增和结果判断，提高了检测的灵敏度。目前采用的实时荧光PCR检测技术主要是两种方法，一种是在PCR反应体系中加入荧光染料，如sybgreen等，随着PCR的进行，荧光染料渗入双链扩增产物而发光。但这种方法的特异性存在缺陷，染料本身的背景荧光和许多非特异扩增产物带来了干扰信号，影响了结果的判断。另外一种方法是Taqman探针法(U.S.Pat.Nos.5,210,015and5,487,972)，这种方法PCR中增加了一条双荧光基团标记的荧光探针，探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。探针未参与反应时，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭不产生荧光信号。当遇到靶核酸序列探针参与反应时，探针被DNA聚合酶的水解作用降价，报告基团离开猝灭基团发出荧光信号。Taqman探针法特异性好，但双标记探针对寡核苷酸合成技术要求高、得率低，导致Taqman探针成本高出普通引物数十倍以上，单一组分成本往往占到整个检测成本的60％以上，提高了临床诊疗费用，影响了这项技术的进一步普及。因此，本专利技术提供一种单标记双引物方法和试剂盒，能大幅度降低荧光标记的技术要求和成本，同时保持实时荧光PCR技术的优势，适合推广使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双引物单标记的扩增方法和试剂盒，可以明显降低荧光PCR方法的成本，同时保持荧光PCR灵敏、特异的特征。本专利技术的
技术实现思路
如下：首先，提供一种用核酸扩增技术检测靶核酸序列的方法，在这个扩增体系中，包括有两条引物，这两条引物分别标记了报告基团和猝灭基团。所述核酸扩增技术是指聚合酶链式反应(PCR)。两条引物的序列符合通常PCR技术要求，分别与靶核酸序列的正链与负链序列互补，在扩增体系中能进行链式聚合反应，产生双链扩增产物。在双链扩增产物中，一条引物携带的报告基团进入扩增产物的一条链，另一条引物携带的猝灭基团进入扩增产物的另一条链。当报告基团和猝灭基团处于同一个双链产物中时，报告基团的荧光会被猝灭基团猝灭而不发出或减弱荧光信号。当PCR反应开始前，两条单标记引物处于分离状态，报告基团未被猝灭，在荧光PCR仪器上能被检测到报告基团的荧光信号。当PCR反应开始后，如果反应体系中包含了靶核酸序列，两条单标记引物就会与靶核酸配对延伸形成双链扩增产物，报告基团的荧光被猝灭基团所猝灭，荧光信号会减弱。随着反应的不断进行，双链扩增产物越来越多，荧光信号会越来越弱，其信号的减弱程度反映了双链扩增产物的数量。反之，如果反应体系中不包含靶核酸序列，两条单标记引物不会发生配对延伸反应，不形成双链扩增产物，报告基团的荧光信号会保持不变。由此，根据荧光信号的变化可以对反应体系中的靶核酸进行检测。在双链扩增产物中，报告基团和猝灭基团的距离会影响猝灭效果，本专利技术发现，距离不超过40个碱基对时猝灭效果较好。所述报告基团是荧光基团，例如常用的FAM、HEX、JOE、VIC等。所述猝灭基团可以是荧光基团，例如TAMRA，也可以是非荧光猝灭基团，例如BHQ。其次，本专利技术涉及一个检测靶核酸序列的试剂盒，它含有包括有两条引物，这两条引物分别标记了报告基团和猝灭基团。试剂盒中还包括DNA聚合酶、脱氧核苷酸、氯化镁等核酸扩增所需其余各常用组分。附图说明图1为引物结构示意图。图2为扩增曲线。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1：引物的设计根据乙型肝炎病毒序列设计引物，正向引物是序列表中的SEQIDNO.1，第16位碱基dG上标记荧光报告基团FAM；反向引物是序列表中的SEQIDNO.2，第16位碱基dA上标记荧光猝灭基团TAMRA。两条引物委托商业序列合成公司合成，HPLC纯化。实施例2：扩增体系的组成PCR扩增体系由Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl50mM、dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.2mM、MgCl23mM、引物各0.15μM组成，并含有1U的TaqDNA聚合酶和104拷贝的HBVDNA模板，总反应体积为30μl。实施例3：反应程序设定和结果判断将配制好的反应体系管放到实时荧光PCR仪器上，预变性94℃2min，然后按照94℃15sec、60℃30sec循环40次的程序运行，在60℃时检测FAM通道的荧光信号。运行结束后根据FAM通道荧光信号的减弱来判断反应体系中含有靶核酸序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用核酸扩增技术检测靶核酸序列的方法，其特征在于扩增体系的两条引物分别标记有报告基团和猝灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用核酸扩增技术检测靶核酸序列的方法，其特征在于，扩增体系的两条引物分别标记有报告基团和淬灭基团，引物序列分别与靶核酸序列的正链与负链互补，经过聚合酶链式反应产生双链扩增产物，并且在双链产物中的报告基团与淬灭基团的距离不超过40个碱基对。2.如权利要求1所述的方法，双链扩增产物的一条链中带有...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医学科技发展有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：