本发明专利技术公开了一种利用多重PCR技术结合SNP敏感性分子开关技术检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的检测试剂盒及其扩增方法和检测方法。所述试剂盒对同型半胱氨酸代谢相关的四个SNP位点进行分型，包括：MTHFR基因rs1801133?SNP位点、MTR基因rs1805087?SNP位点、MTRR基因rs1801394SNP位点和CBS基因rs5742905?SNP位点。所述试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶、细胞裂解液和甘油，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述四个SNP位点的分型，从而了解受试者同型半胱氨酸代谢能力和叶酸、VB12和VB6需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用多重PCR结合分子开关技术检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒及其扩增方法和检测方法，特别涉及一种检测同型半胱氨酸代谢的MTHFR基因 rsl801133 SNP 位点、MTR 基因 rsl805087 SNP 位点、MTRR 基因 rsl801394 SNP 位点和CBS基因rs5742905的单核苷酸多态性(SNP)的试剂盒以及多重PCR扩增方法，属于生物医学领域。
技术介绍
同型半胱氨酸(HCY)，或称为高半胱氨酸或同半胱氨酸，是从S-腺苷基甲硫氨酸透过两个反应步骤途径形成，并能回转成甲硫氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸或牛磺酸。缺乏维他命如叶酸、VB6或VB12，HCY水平都会上升。补充叶酸、VB6、VB12或三甲基甘氨酸会减少血液内的HCY的浓度。高水平的HCY与心脑血管疾病，胎儿发育异常，肿瘤发生等密切相关。叶酸，HCY的代谢中相关酶基因的突变将导致酶活性的降低，使HCY水平上升。MTHFR编码的四氢叶酸还原酶是叶酸和HCY代谢过程中关键酶，能将5，10-亚甲基四氢叶酸装变为5-甲基四氢叶酸，从而参与甲硫氨酸代谢循环和DNA甲基化。正常的MTHFR活性能保持叶酸和甲硫氨酸循环的有效性，维持体内HCY的正常水平，C677T多态使酶活性显著降低，导致5-甲基四氢叶酸生成障碍，引起HCY血症。MTR编码的5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶，是一种维生素B12依赖的甲硫氨酸合酶，催化甲硫氨酸生物合成的最后一步，由进入细胞内的5-甲基四氢叶酸提供甲基，催化HCY再甲基化生成甲硫氨酸，MTR基因2756A/G突变导致919位氨基酸由天冬氨酸转为甘氨酸，引起MTR功能障碍，导致HCY再甲基化途径受阻，体内HCY水平和甲硫氨酸循环异常。MTRR基因是甲硫氨酸合成酶的辅助因子，催化甲钴胺再生，其常见的多态性66A/G会导致甲硫氨酸被异亮氨酸所取代，因此对于维持甲硫氨酸和四氢叶酸及HCY在体内正常水平有重要作用。CBS是磷酸吡哆醛酶，是体内HCY分解代谢的关键酶，在其催化下与丝氨酸缩合成胱硫醚，进一步代谢为半胱氨酸和α -酮丁酸随尿液排出体外，T833C位点突变是其最常见突变位点，使异亮氨酸代替278位的苏氨酸，引起CBS结合位点的构象变化，造成CBS缺陷，进而影响体内HCY的代谢，导致HCY的升高。
技术实现思路
同型半胱氨酸代谢相关酶MTHFR、MTR、MTRR和CBS的基因遗传多态性直接或间接影响同型半胱氨酸在体内的代谢过程。本专利技术提供一种利用多重PCR结合分子开关技术检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒及其扩增方法和检测方法。 本专利技术采用的技术方案:一种检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒，所述试剂盒能同时对MTHFR基因rsl801133 SNP位点、MTR基因rsl805087 SNP位点、MTRR基因rsl801394 SNP位点和CBS基因rs5742905SNP位点的四个SNP位点进行分型检测检测。所述试剂盒包括检测MTHFR基因rsl801133位点的两个正向引物及一个反向引物、检测MTR基因rs 1805087 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测MTRR基因rsl801394 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物和检测CBS基因rs5742905 SNP位点的两个正向引物所述检测MTHFR基因rsl801133位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型弓I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG正向突变型弓I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA反向共用弓 I 物:TGCTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCC所述检测MTR基因rsl805087位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGT正向突变型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGC反向共用引物:CCAGTCCCTTCTTTGGCTTGTGCAG所述检测MTRR基因rsl801394位点的引物喊基序列如下所不:正向野生型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAT正向突变型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAC反向共用引物:TGTGGCTCAAGTTTTGTTCAGGTTCTTG所述检测CBS基因rs5742905位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAA正向突变型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAG反向共用引物:TTGGGTTTCTCATCCTGCCTCTGAGG。所述的检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对4个目的片段和I个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是:内对照733bp，MTRR rsl801394515bp, MTR rsl805087 319bp, CBS rs5742905 193bp, MTHFR 基因 rsl801133 123bp ;扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断4个SNP位点的基因型。所述的检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤:预变性由I次循环构成,其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94°C，时间为30秒；退火:温度为56 °C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒； 扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本专利技术与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本专利技术采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对4个包含SNP位点的DNA片段和I个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。(2)本专利技术采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本专利技术扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本专利技术的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2X扩增缓冲液，使用者只需加入全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本专利技术的试剂盒 所提供的野生型和突变型2X扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loadingbuffer,避免人为错误。具体实施例方式本专利技术检测同型半胱氨酸代谢相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒可同时对MTHFR基因rsl801133 SNP位点、MTR基因rsl805087SNP位点、MTRR基因rsl801394 SNP位点和CBS基因rs5742905 SNP位点进行扩增分型检测，以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测同型半胱氨酸代谢相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒能同时对MTHFR基因rs1801133?SNP位点、MTR基因rs1805087SNP位点、MTRR基因rs1801394?SNP位点和CBS基因rs5742905?SNP位点的四个SNP位点进行分型检测检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩俊领，杜宏伟，周毓玲，崔丽娟，
申请(专利权)人：协和干细胞基因工程有限公司，天津滨海协和基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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