本发明专利技术公开了一种APOE基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法。所述试剂盒对APOE基因上明显改变其产物活性的两个常见的多态性位点进行分型，包括：rs429358SNP位点和rs7412SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述两个SNP位点的分型，从而对APOE基因进行基因分型，为该基因所表达的酶的活性的预测提供分子生物学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法和检测方法，尤其是利用多重PCR结合分子开关技术检测APOE酶活性相关的SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
技术介绍
载脂蛋白E(apolipoproteinE, apoE)是血衆载脂蛋白一个重要组成部分，是1973年首先在正常人的极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的，由299个氨基酸组成的单一多肽链，相对分子量为34kD的糖蛋白。人类apoE主要存在于VLDL、LDL、CM和CM残骸(Chy1micronremm-ants)中，也存在于β -VLDL和HDL的亚类HDL1和HDLc中。它主要在肝脏合成，约占血浆apoE的2/3-3/4。ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，对血脂代谢起重要的调节作用，近年来研究发现，APOE基因多态与冠心病、老年性痴呆(Alzheimer’ s, AD)及老化等疾病有关。Apo E是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3和E4，其基因APOE上存在 2 个 SNP 位点:Cysl 12Arg(rs429358)和 Argl58Cys (rs7412)，野生型基因为 Cysll2、Argl58，表达为E3蛋白；E4蛋白为rs429358突变，即Argl 12 ;E2蛋白为rs7412突变，即Cysl58。ApoE的主要生理功能是通过与LDL受体结合并参与LDL代谢过程，APOE基因的变异可影响LDL受体结合活性而影响脂质代谢，进而影响疾病的发生。
技术实现思路
APOE基因上两个中国人常见SNP直接影响APOE酶的活性，影响多疾病的发生。本专利技术提供一种利用多重PCR结合分子开关技术对APOE基因进行基因检测的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测 方法。本专利技术采用的技术方案:一种APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测基因APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。所述试剂盒包括检测APOE基因rs429358位点的两个正向引物、APOE基因rs7412位点的两个正向引物、APOE基因内参上游引物及一个反向共用引物。所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突变型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突变型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物:正向内参引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用弓I物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA。所述的APOE基因检测试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和I个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是:内对照398bp，rs429358264bp，rs7412129bp ;扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断2个SNP位点的基因型。所述的APOE基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤:预变性由1次循环构成，其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94 °C，时间为30秒；退火:温度为65°C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本专利技术与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本专利技术采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对2个包含SNP位点的DNA片段和I个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。(2)本专利技术采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本专利技术扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本专利技术的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2X扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本专利技术的试剂盒所提供的野生型和突变型2X扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，避免人为错误。扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加A loading buffer,操作方便快捷。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒可同时对APOE基因上的rs429358位点和rs7412位点进行扩增分型检测，以APOE基因为内参来检测扩增条件；野生型2X缓冲包含上述2个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和上游内参引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2 X缓冲液包含上述2个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和上游内参引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突变型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突变型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因内参上游弓丨物和共用下游引物:正向内参引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用引物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA本专利技术试剂盒的组分和含量包括:野生型2 X扩增缓冲混合液，突变型2 X扩增缓冲混合液，高保真聚合酶。本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例步骤1:全血细胞裂解液的制备取受检者外周静脉血300 μ 1，加入700 μ I细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心I分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加Λ 300 μ I双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。步骤2 =PCR扩增反应1、配置野生型反应体系:PCR管内加入细胞裂解悬液4.8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因APOE?rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩俊领，杜宏伟，周毓玲，崔丽娟，
申请(专利权)人：协和干细胞基因工程有限公司，天津滨海协和基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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