一种昆虫基因检测方法技术

本发明专利技术涉及一种昆虫基因检测方法，其使用昆虫卵作为检测对象，以杂交膜为载体，结合Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA。所述方法成本低、灵敏度高，可以方便的进行大规模昆虫DNA检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，更具体地涉及一种基于昆虫卵的基因检测方法。
技术介绍
昆虫是动物界中无脊椎动物的节肢动物门昆虫纲的动物，是所有生物中种类及数量最多的一群，是世界上最繁盛的动物，至今已发现100多万种。昆虫之所以能够长久兴旺的存在于地球之上，与其基因突变个体的大量存在不无关系。基因突变个体的大量存在给昆虫生存提供机会，但也给农业生产带来麻烦。由于昆虫个体变异迅速，造成农业生产中常用的农药在使用过程中由于抗药性个体的迅速出现，而大大缩短了该种农药的使用寿命。 在抗虫植物的推广过程中也存在同样的问题。对昆虫基因突变个体实时监测，有利于延长农药和抗虫植物的使用年限。现在对昆虫基因突变个体的监测一般通过生物测定和分子检测技术，相对于分子检测，生物测定技术耗时耗力。现如今的分子检测一般通过PCR检测或芯片技术。使用PCR 技术首先要提取昆虫的基因组DNA，设计基因检测引物，使用昆虫的基因组DNA作为模板进行PCR反应，对PCR产物进行分析，根据扩增片段的大小或序列测定进行昆虫基因变异情况的判断。基因芯片是指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的DNA探针(片段) 有序地固定在载体表面，从而形成贮存有大量信息的DNA芯片。与待测样品DNA作用后，即可在短时间内快速准确地获取样品中的基因突变信息。基因芯片需要专用的仪器设备，价格昂贵，且对技术要求较高。这些技术都需要提取DNA，由于昆虫卵相对较小，DNA含量低， DNA提取十分困难，所以DNA提取过程中一般使用昆虫的幼虫或成虫。而提取DNA的时候要杀死昆虫，造成该品系昆虫无法继续繁殖后代，影响对该品系昆虫的其他方面研究。因此，有必要提供一种成本低、灵敏度高的用于大规模昆虫基因检测的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了，其使用昆虫卵作为检测对象，以杂交膜为载体，利用Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA。本专利技术所述的昆虫基因检测方法包括以下步骤(1)将单个或多个昆虫卵分别破碎于杂交膜上；(2)使用裂解液处理步骤(1)获得的杂交膜上的破碎的昆虫卵；(3)将步骤⑵获得的杂交膜在2 X SSC溶液中清洗；(4)将步骤(3)获得的杂交膜烘干以固定DNA ；(5)将步骤(4)获得的杂交膜置于杂交袋中，作标记，将预热的杂交液加入杂交袋中，将杂交袋内的空气排空并将杂交袋密封，然后将密封的杂交袋放入杂交炉中预杂交 0. 5-4小时；(6)对步骤( 获得的杂交膜根据目标探针标记类型进行Southern杂交检测。3上述昆虫基因检测方法中，步骤(1)所述杂交膜可为尼龙膜，所述多个昆虫卵可通过施加机械压力的方式被破碎于所述杂交膜上。步骤(2)所述的裂解液包括氯化钠100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、EDTA 50mmol/L、SDS 0.5% (w/v)、蛋白酶K 2-%ig/ml，所述裂解液的pH值为7. 4。步骤O)的处理温度可为65°C，处理时间可为0. 5-2小时(优选1小时)。步骤(3)所述2XSSC溶液包括氯化钠0. 3mol/L、柠檬酸钠0.03mol/L，所述 2XSSC溶液的pH值为7.0。步骤(3)的清洗次数可为2次，每次10分钟，并于清洗时不断摇动杂交膜。步骤的烘干方式可包括以下方式的任意一种于烘箱中在120°C下烘30分钟，在80°C下于真空中烘2小时，经254nm紫外光照射2分钟。步骤(5)所述的杂交液包括6XSSC，5XDenhardt，0. 5% (w/v) SDS 和 100 μ g/ml 的鲑鱼精DNA，所述杂交液加入杂交袋的比例可为8-12mL/100cm2 (优选lOmL/lOOcm2)，所述预热温度可为42°C，所述密封的杂交袋在杂交炉内的预杂交温度可为42°C。步骤(6)所述目标探针用带有标记物的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸标记，步骤(6)包括用酶化学法检测所述Southern杂交的结果。本专利技术所述的昆虫基因检测方法成本低、灵敏度高，可用于大规模的昆虫DNA检测。由于昆虫产卵量十分高，且根据孟德尔遗传规律推断，每只雌虫的卵中都可能有数粒遗传基因相同的卵存在，因此，直接使用昆虫卵作为检测对象，就可以保证与检测卵具有相同遗传背景的昆虫继续存活，从而可以继续繁殖，继续对其研究。之所以能够使用昆虫卵作为研究对象，是因为本专利技术不需要直接提取昆虫卵的DNA，而是通过特殊的裂解液直接将昆虫卵DNA裂解到杂交膜上，这种特殊裂解液是针对昆虫卵的特殊性，根据已有的细胞裂解液改进而来，因为尼龙膜带有正电荷，释放的DNA将被杂交膜直接吸附。而且本专利技术所使用技术是比较成熟的Southern杂交技术，成本低，对技术条件无特殊要求。使用本方法无需直接提取昆虫卵的DNA，而是将单粒卵或多粒卵的DNA直接固定于杂交膜上，结合Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA，从而判断该品系昆虫中的基因变异情况。本专利技术仅使用昆虫卵作为检测对象，可以方便的进行大规模昆虫DNA检测。本专利技术使用Southern杂交技术，检测灵敏度高，克服了昆虫卵小、DNA难以提取的难题，且每条探针可以重复使用，大大减少了检测成本。本专利技术仅用数粒昆虫卵即可推断出该品系昆虫基因变异情况，不影响该品系的正常饲养繁殖。总之，本专利技术所述的昆虫基因检测方法具有如下优点1.操作简单，结果稳定。本专利技术使用的Southern杂交技术是传统的分子生物学技术，技术成熟，检测灵敏度高。2.应用广泛，方便大规模检测。本专利技术几乎可以检测所有昆虫的卵，每张杂交膜可同时检测数百粒卵。3.成本低。本专利技术中所用的检测探针可以重复利用，大大减小了检测成本。附图说明图1所示为杂交膜(尼龙膜)上卵破碎位置的颜色反应结果。 具体实施例方式下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本专利技术。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本专利技术的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本专利技术来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本专利技术的范围仅由所附权利要求界定。实施例1使用河南安阳中国农业科学院棉花研究所室内饲养的敏感品系棉铃虫所产的卵进行基因检测，以对本专利技术的方法的灵敏性进行测试，分别使用敏感品系棉铃虫新产的卵和孵化5天的卵。具体方法如下(1)破碎使用圆头组织研磨杵施加机械压力使单个昆虫卵破碎于尼龙膜上，按同样方法使多个昆虫卵分别破碎于尼龙膜上。并使用敏感品系棉铃虫DNA(从敏感品系棉铃虫个体提取出的DNA)作为阳性对照。(2)裂解使用裂解液于65°C的温度下处理尼龙膜上的破碎的昆虫卵1小时，所述裂解液包括氯化钠 100mmol/L、Tris-HCl 1 Ommo 1/L、EDTA50mmol/L、SDS 0. 5% (w/v)、蛋白酶K 2mg/ml，所述裂解液的pH值为7. 4。(3)洗膜将处理后的尼龙膜放入2XSSC溶液(氯化钠0. 3mol/L，柠檬酸钠 0. 03mol/L, ρΗ7· 0)中清洗2次，每次lOmin，不断摇动。(4)固定将清洗后的尼龙膜置于烘箱中在120°C的温度下烘30分钟来固定DNA。(5)预杂交将处理好的待杂交的尼龙膜小心置于杂交袋中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张帅，崔金杰，雒珺瑜，王春义，吕丽敏，马艳，蒋伟丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：