【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体地说，涉及一种适用于棉花的精准无pam限制的编辑器、构建方法及应用。
技术介绍
1、基因组定点编辑技术是验证特定基因功能的重要研究工具，到目前为止，使用较为广泛的基因组编辑技术共有三大类，分别是锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,zfns)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator like effectornucleases,talens)和成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspacedshort palindromic repeat/crispr-associated protein,crispr/cas)系统，这些技术的出现大大推进了基因功能研究的进程。然而由于zfn、talen对技术要求较高，载体构建复杂，成本较高，制约了这两项技术的应用。crispr/cas由于其操作简单，构建方便，基因编辑效率高，可同时编辑多个靶位点等优点，被广泛应用于多个研究领域。
2、crispr/cas系统以sgrna引导、cas蛋白切割的方式运作，当cas蛋白与sgrna结合后，通过碱基互补配对的方式与目标编辑序列结合并切割，造成dna双链断裂，诱发细胞内的自身修复机制(nhej和hdr)，产生随机或者定向的突变。但是目前该系统仍存在一些问题：pam序列相对固定，造成可编辑位点存在限制。针对pam序列识别限制的问题有两种解决思路，一是筛选不同家族的cas蛋白，例如cas12a、cas12b和casφ等可以识别富
3、棉花是重要的经济作物，种植品种主要为陆地棉(g.hirsutum l.)，是典型的异源四倍体植物，其基因组庞大而复杂，众多基因存在高度同源的拷贝，需要精准度高且特异打靶目标基因的编辑器来加速优异基因的利用。通过对crispr/cas系统进行一系列的特异性改造，达到定点精准编辑的目的，通过编辑调控特定性状的基因创制富含优异位点的种质资源，从而培育出抗逆、高产的棉花新品种。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种适用于棉花的精准无pam限制的编辑器、构建方法及应用，这种基因编辑工具可以应用于棉花优良材料的创制。
2、本专利技术利用spcas9的变体spry(d10a)具有无pam限制的广谱靶向性，并结合棉花密码子优化后获得新的基因，命名为ghspry，再以ghspry作为基础，将获得的ghspry基因整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过棉花遗传转化实现对棉花特定基因的编辑，从而创造了一种精准无pam限制的适用于棉花的编辑技术。
3、具体而言，在第一个方面，本专利技术提供一种适用于棉花的精准无pam限制的编辑器，所述编辑器的基因序列至少包含ghspry基因序列，ghspry基因序列包含如seq id no.1所示的核苷酸序列。
4、在第二个方面，本专利技术提供一种表达盒，所述表达盒至少包含上述编辑器。
5、在第三个方面，本专利技术提供一种植物表达载体，所述表达载体至少包含上述编辑器或上述表达盒。该植物表达载体是将编辑器的基因序列整合到植物表达载体上得到，具体的构建方法为在swai/maubi酶切位点，对wmc016载体酶切并回收，在ghspry序列两端加有swai/maubi酶切位点及同源臂序列，利用同源重组将ghspry连接到wmc016载体，得到植物表达载体wmc016-ghspry。
6、另一方面，本专利技术提供一种上述编辑器、表达盒或表达载体的应用，包括利用所述编辑器实现对棉花特定基因的编辑。
7、另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。
8、本专利技术提供一种wmc016-ghspry表达载体，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(wmc016-ghspry-stm)，将打靶载体导入棉花细胞的方法。
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1.一种适用于棉花的精准无PAM限制的编辑器，其特征在于，所述编辑器的基因序列至少包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒至少包含权利要求1所述的编辑器。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体至少包含权利要求1所述的编辑器或权利要求2所述的表达盒。
4.一种如权利要求1所述编辑器的构建方法，其特征在于，所述方法包括在SpCas9的变体SpRY(D10A)的基础上，进行棉花密码子优化。
5.一种如权利要求3所述表达载体的构建方法，其特征在于，将编辑器的基因序列整合到植物表达载体上得到。
6.一种如权利要求1所述编辑器、权利要求2所述表达盒或权利要求3所述表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述编辑器实现对棉花特定基因的编辑。
【技术特征摘要】
1.一种适用于棉花的精准无pam限制的编辑器，其特征在于，所述编辑器的基因序列至少包含如seq id no.1所示的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒至少包含权利要求1所述的编辑器。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体至少包含权利要求1所述的编辑器或权利要求2所述的表达盒。
4.一种如权利要求1所述编辑器的构建方...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛晓阳，詹晶晶，陈艳丽，王晔，刘梦晗，王鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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