本发明专利技术涉及一种谷子糯质基因共分离的分子标记及其检测方法，用于谷子糯质资源的利用及糯质新品种的选育，所述分子标记为InDel分子标记，扩增引物为waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R引物组合。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了谷子IV型糯质基因的分子标记鉴定方法，属于分子遗传学领域，专用于谷子的IV型糯质基因型的分子鉴定。
技术介绍
谷子，脱壳后称小米，小米主要物质为淀粉，含量在75%左右，一般品种直链淀粉含量在12. 8%以上，糯性品种直链淀粉含量在I. 24% -7%之间。糯小米粒小，色淡黄或深黄，质地较硬，糯小米淀粉分子量比普通小米小20多倍，食用消化率比普通小米高20%以上，它还具有较高的粘滞性和良好的适口性，制成品有甜香味。加温处理的糯小米淀粉具有较高的膨胀力和透明性，这些优良特征赋予糯小米宝贵的价值和广泛的用途。小米是一种营养丰富的食品，在国外糯小米也被评为“营养之王”而列为“保健食品”。经常食用小米对维持蛋白质、氨基酸的代谢平衡都有重要的作用。糯小米的功效主要有I.因其富含维生素BI、B12等，具有防止消化不良及口角生疮的功效；2.具有防止泛·胃、呕吐的功效；3.还具有滋阴养血的功能，可以使产妇虚寒的体质得到调养，帮助她们恢复体力；4.糯小米具有减轻皱纹、色斑、色素沉着的功效。为此，糯小米有无限的加工开发潜力，对拉动我国特色谷子产业发展具有重要的作用。十里香系优质糯性谷子资源，但其它农艺性状很差。豫谷I号系获国家专利技术奖的优良品种，梗性品质。由豫谷I号X(1066A不育材料X十里香)F4复合杂交选育而成的冀创I号(本课题组选育)，是高产、优质糯性品种，其直链淀粉含量(占样品干重)仅I. 22%，在国内谷子糯质品种中含量处于最低水平，表明其为高糯质品种。目前已经制成糯小米酒、儒小米醋、儒小米乳、粘糕等具有儒质特色的小米加工成品。冀创I号的选育过程历经15年，而分子标记辅助育种技术通过对目标基因快速而精确的选择，可以为育种提供了非常有效的工具。如果再以目标基因间的差异作为标记，可有效地避免分子标记与目标基因连锁互换的问题，同时可以在苗期进行选择，用PCR技术对DNA的质量要求不高，而且实用性很强，从而大大缩短了育种周期，也提高了选择效率。为此，本研究开发了可以对糯质性状进行基因型鉴定的共显性分子标记，为建立谷子糯质基因鉴定的技术体系奠定了基础，可以大大提高谷子糯质育种进程，促进谷子产业化发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种糯质谷子鉴别的分子标记方法，利用本研究开发的基于PCR的实用经济型标记，可以有效地从谷子中鉴定出含IV型糯质基因的糯质谷子，用于谷子糯质资源的利用及糯质品种的选育，所述标记为waxy-TSI2/intl和waxy-intl_lF/4R0本专利技术涉及一种鉴别谷子糯质基因的分子标记方法，其特征在于 用二对特异扩增谷子糯质基因的共显性InDel分子标记引物，分别命名为waxy_TSI2/inti和 waxy-intl_lF/4R waxy-TSI2/intl 上游引物5’ GAAGTGGAGGATACTGATGGG 3’ waxy-TSI2/intl 下游引物5’ GGATTTGACTGCATGAAAATG 3’ waxy-intl-lF/4R 上游引物5’ CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’ waxy-intl-lF/4R 下游引物5，AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3 扩增谷子的DNA，若waxy-TSI2/intl引物组合能扩增出984 bp的扩增片段，并且waxy-intl-lF/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段，则该材料为含IV型糯质基因的糯质谷子。本专利技术所提供的可鉴别糯质谷子的InDel标记，是通过以下方法获得的 I)从谷子种质资源中选育出优质糯谷子十里香，将其与梗质谷子品种豫谷I号配制正 反交杂交组合F1。收获正反交F1后再自交，构建糯质基因的F2分离群体，F2所结F3种子经过碘液染色，梗质单株与糯质单株的分离比例符合3 1，说明十里香的糯性由隐形单基因控制。2)谷子的Waxy基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS1 )，决定谷子胚乳和花粉中的直链淀粉合成。普通谷子(WxWx)籽粒中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。糯谷子(wxwx)籽粒中含有少量或不含直链淀粉，几乎全部由支链淀粉组成。因为不同转座子插入GBSSI基因序列的不同位点，Waxy基因突变成各种不同的等位基因，减弱或消除了 GBSSI基因的表达，对其编码蛋白颗粒凝结型淀粉合成酶的酶活影响界于5%至95%之间，从而形成糯质(waxy)或低淀粉含量(low-amylose)性状。根据文献(Mol Gen Genomics, 2005, 274 131 - 140)已经报道的区分糯质类型的4对引物序列，我们合成该4对引物，序列如下 exl/ex2引物核酸碱基序列 上游引物5，TGCAAGCCAGTGACGGATCGACGACGACAC3， 下游引物5’ ATGCCGGTGACCAGCGTGGAGGGCTAGCTA3’ ex2int2/ex4r引物核酸碱基序列 上游引物5 ’ CATGGCCGTAAGTCCCATCGATCGATCATC3， 下游引物5’ TAGCAGTGGAAGAACCTCACCCTCTCGTAC3’ M5/R7引物核酸碱基序列 上游引物5 ’ GGACGTCAGCGAGTGGGACC3， 下游引物5’ ACGAGTCCACCGGTGGACGC3’ M7/R10引物核酸碱基序列上游引物5 ’ CACCAGCCGCTTCGAGCCCT3 ’ 下游引物5’ GCCGGCGTGCCGACCACCTT3’ 如图I所示，其中，只有exl/ex2引物组合对谷子父本糯质十里香与母本梗质豫谷I号的基因组DNA扩增产物不同(其它3组引物扩增产物均相同)，前者扩增片段在5 kb左右，后者扩增片段是828 bp。通过对父本PCR产物部分测序证实，扩增片段序列与giI 62318482 IdbjIAB210215. 11 Setaria italica GBSSl gene, transposable elementTSI-2 in intron I完全匹配，说明十里香属于IV型糯质基因，是由TSI-2转座子插入到GBSSl基因的内元I形成的，TSI-2转座子大小是5251 bp。利用转座子TSI-2序列和GBSSl内元I序列，设计一对InDel标记引*raXy_TSI2/intl，可以鉴别出IV型糯质纯合隐性和杂合显性基因型；利用TSI-2插入位点所在的内元I序列，又设计了一对InDel标记引物waxy-intl-lF/4R，可以鉴别梗质纯合和杂合基因型，即二对引物同时使用能够排除IV型糯质基因型中杂合基因型的干扰。二对InDel标记引物序列如下，waxy-TSI2/intl标记的引物核酸碱基序列是上游引物5 ’ GAAGTGGAGGATACTGATGGG 3 ’ 下游引物5’ GGATTTGACTGCAT GAAAATG 3’ waxy-intl-lF/4R标记的引物核酸碱基序列是上游引物5 ’ CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3， 下游引物5’ AGTGGGITCGATGITTGAAC3’ waxy-TSI2/intl标记引物能够在十里香中扩增出984 bp条带,母本中没有扩增条带；waxy-in本文档来自技高网...
【技术保护点】
鉴别谷子糯质基因的分子标记方法，其特征在于：用二对特异扩增谷子糯质基因的共显性InDel分子标记引物，分别命名为waxy？TSI2/int1和waxy？int1？1F/4R：waxy？TSI2/int1上游引物：5’？GAAGTGGAGGATACTGATGGG？3’waxy？TSI2/int1下游引物：5’？GGATTTGACTGCATGAAAATG？3’waxy？int1？1F/4R上游引物：5’CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’waxy？int1？1F/4R下游引物：5’AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3’扩增谷子的DNA，若waxy？TSI2/int1引物组合能扩增出984？bp的扩增片段，并且waxy？int1？1F/4R引物组合不能扩增出540？bp的扩增片段，则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：白辉，李志勇，朱彦彬，全建章，曹伟月，董立，马继芳，刘磊，郑直，董志平，
申请(专利权)人：董志平，
类型：发明
国别省市：
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