本发明专利技术提供一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒，由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成，限制性内切酶包括限制性内切酶NlaⅢ；阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。本发明专利技术的试剂盒可在检测与Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNAA4435G突变中的应用。本发明专利技术可确保检测结果的特异性和稳定性，成本较其他检测方法更低，是检测流程简便、快速，准确、经济的LHON相关基因突变检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及一种与Leber病调控子相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体tRNAMet A4435G突变的方法，还涉及用于检测与Leber病调控子相关的线粒体DNA A4435G突变的试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体DNA A4435G突变中的应用。
技术介绍
Leber 遗传性视神经病变(Leber，s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,简称Leber病)是视神经病变的一种类型，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部(http://www. moh. gov. cn/)最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万,盲人约有500万，占总人数的0. 4%，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病变引起的约为55万。1871年德国眼科医生Theodor Leber首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性。1972年Erickson等发现LHON的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年WallaceDC等发现了第一个与LHON相关的线粒体基因组DNA (mitochondria DNA, mtDNA)突变位為、ND4 G11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://WWW.mitomap. org/)，其中 tRNAMet A4435G 和 tRNAThr A15951G 等被称为 “Leber 病调控子”。与线粒体DNA突变相关的Leber遗传性视神经病变在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的LHON的发生有着极其重要的作用。自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来，国内相继报道了 Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号200510006097. 8)，该专利技术是根据90 %以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变(G11778A、G3460A和T14484C)，设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号200610003429. I)。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时，需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基，其在DNA聚合酶的作用下开始延伸，带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR 扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒，由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成，其中，提取样本基因组DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，所述的引物序列外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GATTAT GGA TGC GGT TG;内前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，内反向引物 R: AATCAG TGC GAG CTT AGC GC ;限制性内切酶包括限制性内切酶III ;阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本、阴性标本对照是不含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。在上述试剂盒中，在PCR扩增反应试剂中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜(0. 1-0. 2 y I为宜)。本专利技术的再一个目的是提供所述试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNA A4435G突变中的应用。通过以下步骤实现 (1)基因组DNA的提取运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液的样本中提取基因组DNA ; (2)特异性PCR扩增使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件根据SEQ ID N0:5所示的人类线粒体基因序列设计引物包含突变位点的基因片段3777-4679，外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA (SEQ ID NO: 1)，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG(SEQ ID NO: 2);内前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT (SEQ ID NO: 3)，内反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC (SEQ ID N0:4)； (3)酶切鉴定将上述PCR产物用限制性内切酶A^aIII对A4435G突变位点处进行酶切； (4)突变检测琼脂糖凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生A4435G突变。在上述检测A4435G突变的方法的步骤(I)中，样本来源于从毛细血管静脉血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理，样本预处理方法如下 (1)血标本或血滤纸片取20 200ill少量血标本(如一滴血)或Icm2的血滤纸片放A I. 5ml EP 管(Eppendorf 管)，加入 900 U I 红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.6)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀； (2)带毛囊的毛发用70%乙醇洗带毛囊的毛发I次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2 4根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分； (3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前，必须让被收集者漱口。以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒，由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成；其中，提取样本基因组DNA的试剂由细胞裂解液和主要成分是蛋白酶K的溶液Ⅰ组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸Taq水和酶；引物序列是：外前向引物F:？TGG？CTC？CTT？TAA？CCT？CTC？CA，外反向引物R:？AAG？GAT？TAT？GGA？TGC？GGT？TG；内前向引物F:？CCT？ACC？ACT？CAC？CCT？AGC？AT，内反向引物R:？AAT？CAG？TGC？GAG？CTT？AGC？GC；限制性内切酶包括限制性内切酶NlaⅢ；阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本、阴性标本对照是不含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：管敏鑫，冀延春，蒋萍萍，张娟娟，肖云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
2来自[未知地区] 2013年04月18日 13:52这个专利还是有点用处的，使我们更快更准确的检测，是人类的一大福音