一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种肝癌衍生生长因子HDGF检测试剂盒，包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。本发明专利技术还提供一种肝癌衍生生长因子HDGF检测试剂盒的制备方法，包括构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；表达HDGF蛋白原核细胞；产生抗HDGF抗体并纯化；制备时间分辨荧光试剂盒。采用本发明专利技术的肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法，制备简便、操作流程短，检测重复性好、灵敏度高、无放射性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测用的试剂盒，尤其涉及一种用于肝癌衍生生长因子HDGF检测的检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
肝癌衍生生长因子HDGF具有促进细胞增殖、分化，组织器官生长发育，损伤后组织修复等功能，参与体内多种生理病理过程。HDGF能促进胎肝细胞增殖，参与胎肝发育过程中肝细胞生长发育调控。在大鼠颈动脉气囊扩张损伤模型中，损伤后的动脉新生内膜及肌层HDGF表达明显增高，HDGF参与血管损伤后新生内膜形成中血管平滑肌细胞的增殖与迁移反应。我们研究胃上皮细胞癌HDGF表达时发现，HDGF核标记指数HDGF-LI在胃癌前病变，如肠上皮化生和不典型增生，发展过程中逐渐增加，如肠上皮化生和不典型增生。胃癌早期继续增加，在进展期胃癌表达水平更高，提示HDGF参与胃癌的形成。胃癌UICC I期患者HDGF-LI低于nCC I1、II1、IV期患者，无淋巴转移NO患者HDGF-LI低于淋巴结转移N1、N2、N3患者，浸润黏膜及粘膜下层肿瘤相对于侵袭浆膜层肿瘤HDGF-LI低，提示HDGF表达水平与胃癌分期、胃癌淋巴结转移及侵袭深度相关。HDGF与肿瘤发生、发展有关，在肿瘤组织中表达增加，HDGF 与肿瘤患者预后相关，有望成为肿瘤诊断新的分子标志物及潜在治疗革巴点。HDGF现有检测方法主要有免疫组化和ELISA法，但是免疫组化是半定量的蛋白检测方法，且检测过程繁琐；而ELISA法的检测灵敏度和重复性均较差。有鉴于此，制备一种检测过程简单，灵敏度高、重复性好的肝癌衍生生长因子检测试剂盒成为提高HDGF检测质量和效率的一项重要研究课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的免疫组化和ELISA法检测过程繁琐，灵敏度不高，重复性较差的问题，提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法。根据本专利技术，一方面提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒，包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒用于肝癌衍生生长因子HDGF的检测；优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的检测成分为患者血液或者血浆成分；优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒中用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体是通过下述方法制备的:a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；b)表达HDGF蛋白原核细胞并纯化HDGF蛋白；c)产生鼠抗HDGF单克隆抗体并纯化；d)用镧族金属元素Eu络合生物素形成的复合物标记二抗；优选地，步骤d)采用缓冲液稀释鼠抗HDGF单克隆抗体并涂布于固相上，35 39°C孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用稀释液稀释络合的结合物后涂布于固相上，35 39°C孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次；本专利技术的另一方面，提供了一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤:a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体，用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将HDGF克隆至pET28表达载体；b)表达HDGF蛋白原核细胞，用His金属镍IDA螯合树脂柱纯化HDGF蛋白，用Thrombin酶切除His-tag标签,得到HDGF蛋白；c)产生抗HDGF抗体并纯化，将已切除标签的HDGF作为抗原免疫大白兔和大鼠，产生HDGF抗体,收集血清，用硫酸铵沉淀、透析、protein-A-Sepharose亲和柱纯化兔抗HDGF多克隆抗体和鼠抗HDGF单克隆抗体；d)制备时间分辨荧光试剂盒，在固相上结合兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素Eu络合生物素形成复合物并标记二抗。优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法中步骤d)将用含NaCL的磷酸盐缓冲液稀释一抗溶液并将其涂布到固相上，2 6°C孵育20h以上，将一抗固定到固相。用洗涤缓冲液洗涤涂布了一抗的所述固 相表面。洗涤后将固相保存于_20°C，直至需要进行测定之前。预先用稀释缓冲液对血液样本进行稀释。涂布于固相上，35 39°C孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次，接着用缓冲液稀释的鼠单克隆抗体涂布于固相上，35 39°C孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用稀释液稀释络合的结合物后涂布于固相上，35 39°C孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。将含镧族元素Eu的复合物进行固相或液相的时间分辨荧光测定。测定条件为延迟时间约为0.2 0.3ms，窗口时间约为0.2 0.6ms,闪烁速度为0.5 1.5ms,激发波长为337.1nm,测定波长为615nm ；优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的稀释缓冲液为三羟甲基氨基甲烷Tris和HCL构成的弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，优选pH为7.5 8.0,优选浓度为0.025 0.075M ；优选地，稀释缓冲液还包括牛血清白蛋白BSA和NaCL，其中，BSA优选的浓度为0.15% 0.25%,NaCL的优选浓度为0.6% 1.2%。稀释缓冲液的优选稀释倍数，即体液样本与缓冲液比例为1: 5 1: 15 ;优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的洗涤缓冲液为由Tris和HCL构成弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，含有非离子表面活化剂，表达性为聚氧乙烯山梨糖醇酐酸酷；本专利技术的其它方面，所述
的人员可根据现有技术得知。本专利技术的测定原理:利用聚合酶链式反应技术直接从体外培养的细胞株中将HDGF序列克隆至原核表达载体，通过大肠杆菌表达HDGF重组蛋白，对重组蛋白进行过柱和蛋白标签切除处理后获得高纯度的HDGF蛋白。再将该HDGF蛋白免疫大白兔及大鼠，获得抗HDGF特异性的抗血清，进行Protein A亲和层析获得高纯度、高活性的HDGF兔多克隆抗体和HDGF鼠单克隆抗体。在固相上包被兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素络合生物素形成复合物标记二抗，制备时间分辨荧光试剂盒。本专利技术的有益效果在于:I)肝癌衍生生长因子是HDGF相关蛋白质家族第一个被发现的成员，具有促进细胞增殖、分化，组织器官生长发育，损伤后组织修复等功能。HDGF广泛参与体内生理病理过程，深入研究HDGF，可以解释众多疾病的发生发展；2)HDGF具有增加肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡的功能，HDGF表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移及侵袭深度相关，HDGF参与与肿瘤发生、发展，在肿瘤组织中表达增加，与肿瘤患者预后相关，有望成为肿瘤诊断新的分子标志物及潜在治疗靶点。肝癌衍生生长因子(HDGF)时间分辨荧光分析法(TRFIA)检测试剂盒是研究肿瘤基因表达改变、肿瘤转移及预测肿瘤患者预后的重要手段。附图说明读者在参照附图阅读了本专利技术的具体实施方式之后，将会更清楚地了解本专利技术的各个方面。其中，图1示出了依据本专利技术，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法流程图；图2示出了依据本专利技术，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备中表达HDGF蛋白原核细胞及纯化HDGF蛋白的方法流程图；图3示出了依据本专利技术，肝癌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝癌衍生生长因子HDGF检测试剂盒，其特征在于：所述肝癌衍生生长因子HDGF检测试剂盒包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛建山，纪小微，朱永良，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：