一种针对肝癌的DC‑CTL试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种针对肝癌治疗的DC‑CTL细胞培养试剂盒及其制备和使用方法。该试剂盒使用多种肝癌细胞系表面抗原为DC细胞提供递呈抗原，使用该DC细胞诱导的CTL对表达不同抗原的肝癌细胞都有较强的杀伤活性。同时，该试剂盒将DC‑CTL细胞培养所需的其他试剂进行优化并重新命名，以适应产业化要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域。具体涉及一种针对肝癌治疗的DC-CTL细胞培养试剂盒的制备及使用方法。
技术介绍
肝癌起病隐匿，恶性度高，发病时已多为中晚期，且患者体内天然免疫，尤其是特异性免疫功能低下，放、化疗的疗效差，易发生肝内播散和远处转移，仅有部分患者可接受手术治疗，根治性切除率较低，术后复发率高。20世纪90年代以来,我国肝癌的发病率已上升到恶性肿瘤的第2位，每年约有13万人死于肝癌，死亡人数占全球肝癌死亡总人数的44%。因此，寻找治疗和预防肝癌复发转移的策略及治疗方法具有重要意义。过继性免疫细胞治疗指将体外培养激活扩增的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀伤患者体内的肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫反应的治疗方法。过继性免疫治疗的优点主要表现在以下几个方面。第一，免疫细胞在体外处理，可以绕过肿瘤患者体内免疫障碍的种种机制。第二，免疫细胞的活化及效应过程由一些细胞因子介导，现在的生物技术可大规模的生产多种细胞因子、肿瘤抗原等，使得体外大量扩增肿瘤免疫细胞成为可能。第三，免疫细胞的体外活化扩增可避免一些生物制剂在体内大量应用而带来的严重毒副作用。近年来，许多临床研究使用免疫细胞作为治疗癌症的一种辅助治疗手段，并取得了良好效果。这些研究显示单独的细胞治疗对实体瘤的治疗效果不大，但对于手术或放化疗后患者的复发和转移率有良好的抑制效果。目前，比较有效的过继免疫细胞治疗主要为使用树突状细胞（DC）共培养诱导后的CTL细胞治疗，即DC-CTL治疗。DC细胞为目前发现功能最强大的专职抗原递呈细胞（APC），其表面存在丰富的抗原捕获分子、抗原递呈分子、免疫共刺激分子，具有独特的抗原提呈和激发功能。相关免疫学基础研究及肿瘤研究表明，DC是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用。成熟活化的DC与初始T淋巴细胞相互作用可以诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），而细胞毒性T淋巴细胞是对抗原物质具有杀伤作用的一种特异性T细胞。因此，可以以DC作为载体，经肿瘤抗原体外冲击使其致敏，保证肿瘤抗原被有效摄取、提呈，然后且通过DC与CTL细胞的共培养使CTL细胞获得特异杀伤肿瘤细胞的能力。肿瘤负载DC诱导的CTL细胞治疗方法主要缺陷是：目前已知的肿瘤相关抗原（TAA）较少，临床应用受到限制；必须了解患者的MHC背景，明确肿瘤抗原肽的HLA类型，了解相关表位序列；肿瘤细胞的异质性和遗传不稳定性，用已知的抗原多肽未必能诱导出最佳的免疫反应，需要预防肿瘤抗原免疫逃避变异的可能性。此外，由于各个研究单位使用的技术方案不同，导致在DC-CTL培养过程中出现一下几个问题：DC细胞量少，不足以刺激CTL产生特异性；DC细胞未完全成熟，不能有效提呈肿瘤抗原；收获的细胞中CD3+CD8+CD28+的CTL细胞比例较低，回输后不能产生预期疗效。因此，提供一种能使DC-CTL细胞既具有特异性又能达到有效数量的细胞培养方案显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术提供一种针对肝癌治疗的DC-CTL试剂盒，所述试剂盒包含LSA-A试剂、LSA-B试剂、LSA-C试剂、DC-A试剂、DC-B试剂、CTL-A试剂、CTL-B试剂。所述LSA-A试剂为Ficoll分离液，使用其作为外周血单个核细胞的分离试剂。所述LSA-B试剂为PH=7.3±0.1的磷酸盐缓冲液，使用其作为包被板清洗、血液稀释及细胞洗涤试剂。所述LSA-C试剂为含200-400ng/mlα-半乳糖神经酰胺（α-Galcer）（优选200ng/ml）及多种肝癌细胞系表面抗原的磷酸盐缓冲液。具体地，该试剂包含的多种肝癌细胞系表面抗原是指400-600ug/mlHepG2肝癌细胞系表面抗原（优选400ug/ml）、400-600ug/mlQGY-7703肝癌细胞系表面抗原（优选400ug/ml）、400-600ug/mlSMMC-7721肝癌细胞系表面抗原（优选400ug/ml）、400-600ug/mlEGHC-9901肝癌细胞系表面抗原（优选400ug/ml）中的一种或几种。更具体地，该试剂包含的多种肝癌细胞系表面抗原通过使用液氮反复冻融的方法获得的。所述DC-A试剂为含50-500ng/ml抗CD14单克隆抗体（优选100ng/ml），50-500ng/ml抗CD11c单克隆抗体（优选100ng/ml）的磷酸盐缓冲液，使用其包被的细胞培养瓶（皿）可作用于DC细胞分选。所述DC-B试剂为含1000-1500U/mlGM-CSF（优选1200U/ml）、1000-1500U/mlTGF-β（优选1200U/ml）、600-1000U/mlIL-4（优选800U/ml）以及600-1000U/mlIFN-γ（优选800U/ml）的1640培养基，使用其作为诱导DC细胞分化及扩大的培养基。所述CTL-A试剂为含50-500ng/ml抗CD3单克隆抗体（优选100ng/ml）和50-500ng/ml抗CD28单克隆抗体（优选100ng/ml）的磷酸盐缓冲液，使用其包被的细胞培养瓶（皿）可作用于T细胞的刺激活化。所述CTL-B试剂为含80-100ng/ml抗CD3单克隆抗体（优选80ng/ml）、80-100ng/ml抗CD28单克隆抗体（优选80ng/ml）、80-120ng/ml植物血凝素(PHA)（优选80ng/ml）、200-400U/mlIL-2（优选200U/ml）、50-100U/mlIL-1α（优选80U/ml）的1640培养基，使用其作诱导CTL发生及扩大的培养基，同时，该试剂也作为DC、CTL合并后的DC-CTL细胞的培养。共同地，所述针对肝癌治疗的DC-CTL试剂盒所包含的所有试剂均进行细菌、真菌及内毒素含量检测，且细菌、真菌检测均为阴性，内毒素含量＜2EU/ml。本专利技术的有益效果是：本专利技术提取了肝癌细胞系HepG2、QGY-7703、SMMC-7721、EGHC-9901的表面抗原，使用其为DC细胞提供递呈抗原，使得DC细胞获得多种肝癌细胞的抗原信息，使用该DC细胞诱导的CTL对表达不同抗原的肝癌细胞都有较强的杀伤活性，可用于预防乙肝及肝硬化患者由于病情进展而发生肝癌，也可作为肝癌手术以治疗及放化疗的一种辅助治疗手段，能起到提高治疗效果和防止肝癌复发的作用。进一步地，本专利技术将体外培养DC-CTL所需的试剂、抗原进行命名并组成试剂盒，同时制定标准的试剂盒制备方法及使用方法作为体外DC-CTL细胞培养的标准操作流程，以适应产业化的要求。附图说明图1为使用BCA蛋白定量试剂盒测定肿瘤细胞系表面抗原蛋白量的标准曲线图。由图可知蛋白浓度（mg/ml）=1.32*样本平均吸光值-0.1821，一般地，本专利技术所使用的肿瘤细胞系表面抗原的提取方法所提取的抗原量为11.3mg/1*108个细胞。图2为使用流式细胞术对本专利技术所述试剂盒培养的DC细胞的表型检测结果。图3为使用流式细胞术对本专利技术所述试剂盒培养的DC-CTL细胞的表型检测结果。图4本专利技术所述试剂盒培养的DC-CTL细胞与常规培养的DC-CTL细胞对肝癌细胞系HepG2的杀伤结果统计图。具体实施方式下面结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对肝癌治疗的DC‑CTL细胞培养试剂盒，其特征在于包括以下几种试剂：LSA‑A试剂、LSA‑B试剂、LSA‑C试剂、DC‑A试剂、DC‑B试剂、CTL‑A试剂、CTL‑B试剂。

【技术特征摘要】
1.一种针对肝癌治疗的DC-CTL细胞培养试剂盒，其特征在于包括以下几种试剂：LSA-A试剂、LSA-B试剂、LSA-C试剂、DC-A试剂、DC-B试剂、CTL-A试剂、CTL-B试剂。2.根据权利要求1所述的DC-CTL试剂盒，其特征在于所述LSA-C试剂为含200-400ng/mlα-半乳糖神经酰胺和多种肝癌细胞系表面抗原的磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的DC-CTL试剂盒，其特征在于所述DC-A试剂为含50-500ng/ml抗CD14单克隆抗体和50-500ng/ml抗CD11c单克隆抗体的磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求1或2所述的DC-CTL试剂盒，其特征在于所述多种肝癌细胞系表面抗原主要包括：400-600ug/ml肝癌细胞系HepG2表面抗原、400-600ug...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢戌，杨照敏，刘静维，李丹，王跃，邓丽娟，张晓燕，
申请(专利权)人：北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11