本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种肝癌乏氧的特异分子标志物PKM2及其在精准诊断试剂盒中的应用。PKM2为丙酮酸激酶转录变异体2，是新发现的肝癌乏氧代谢标志分子，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示。本发明专利技术包括含有乏氧肝癌分子标志物PKM2的肝癌乏氧诊断试剂盒；还包括该分子标志物和诊断试剂盒在肝癌乏氧表型高危人群的筛选、肝癌乏氧水平的诊测、肝癌乏氧靶向治疗及状况监测、肝癌乏氧指导用药的监测及肝癌乏氧治疗预后检测等领域的应用。使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断乏氧表型肝癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性、灵敏性和方便大量筛查的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种肝癌乏氧的分子标志物PKM2及其在精准诊断试剂盒中的应用，包括通过该生物分子标志物在肝癌乏氧表型高危人群的筛选、肝癌乏氧水平的诊测、肝癌乏氧靶向治疗及状况监测、肝癌乏氧指导用药的监测及肝癌乏氧治疗预后检测等领域的应用。
技术介绍
肝癌是我国和东南亚地区的多发病和常见病。尤其在我国，每年约有12万人死于此病，约占全世界每年肝癌总死亡人数的42％。近年来，肝癌在我国的发病率还有逐渐增高的趋势。目前，我国肝癌的发病率已由恶性肿瘤的第三位升至第二位，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌。肝癌具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易复发转移、预后差等特点，肝癌的早期诊断和临床治疗疗效均不是十分理想。肝癌乏氧休眠是指肝脏肿瘤组织内部或其小/微转移灶处由于肿瘤乏氧微环境的形成，导致肝癌细胞周期进入G0～G1期静止状态但仍具有增殖潜能。肝癌细胞乏氧休眠现象临床上非常普遍，但各种治疗方案干预后乏氧表型的癌细胞休眠激活是导致肝癌复发和转移的主要根源。许多肝癌患者临床上经组合方案治疗后，体内已无明显癌灶，但在血液、骨髓、淋巴等其他部位存在乏氧休眠的小/微残余癌灶。部分患者在原发癌治疗前，癌细胞转移和乏氧休眠可能早已经发生。由于乏氧表型的原发癌能释放新生血管抑制因子或转移灶特质性的乏氧微环境，使肝癌乏氧休眠临床较为常见，表现为原发肝癌根治不久，整个肝脏、肺、骨骼等多处乏氧休眠的微/小转移灶暴发性生长。由于乏氧休眠的癌细胞对传统放化疗均不敏感、数量较少，且常规临床手段(如X线、超声、CT、MR及PET等)难以有效检测。近年来，虽然有部分研究者认为检测骨髓中DTC(散播肿瘤细胞)和外周血CTC(循环肿瘤细胞)有可能相对地反映患者全身肿瘤乏氧休眠状况，但不容回避的是：骨髓DTC检测在预测转移性复发时存在负相关失效，而CTC半衰期太短(1～2.4h)且易快速凋亡。更何况，各种富集DTC和CTC方法均有缺点：基于大小分离受限于肿瘤细胞大小可变且白细胞会堵塞滤孔，免疫磁珠阳性筛选会漏选不表达靶抗原的DTC和CTC。另外，目前国内外对肝癌乏氧休眠细胞的精准检测还没有报道，这说明，基础研究与临床诊疗实践对肝癌细胞乏氧休眠认知和探究还十分有限，亟需建立可特异精准甄别和靶向肝癌乏氧休眠细胞的特异分子标志物。问题的关键在于，肝癌乏氧休眠细胞是一群数量极少且难以检测的静止细胞。迄今为止，国内外尚缺乏一种特异的分子标志物可以将肝癌乏氧休眠细胞与快速增殖的肝癌细胞或正常肝组织细胞区别开来。由于在体外条件下进行乏氧培养能诱导肿瘤细胞进入静止休眠状态，绝大多数细胞乏氧应激后处于细胞周期G1/G0时相，并且能显著诱导肿瘤细胞进行代谢重编程，出现一些全新的代谢表型。这些现象综合提示，体外乏氧培养可以诱导癌细胞进入休眠状态。通过乏氧培养筛选制备癌细胞乏氧结合的特异抗体，继而基于乏氧特异结合的抗体通过鉴定其相应抗原蛋白，可以挖掘出肝癌休眠细胞乏氧表型的特异分子标志物。我们通过细胞常氧扣除筛选结合乏氧正向筛选，从噬菌体抗体库中淘筛到对肝癌细胞乏氧特异结合的人源抗体。用Protein L beads对其抗原亲和富集免疫沉淀后LC MS/MS质谱鉴定发现，乏氧特异结合抗体对应的抗原蛋白为肿瘤代谢标志分子：丙酮酸激酶转录变异体2(Pyruvate kinase Isoform M2，PKM2)。免疫组化染色表明，PKM2在中、高分化肝细胞肝癌组织呈阳性结合，而与低分化肝癌组织和癌旁非瘤肝组织无结合。最为重要的是，PKM2在肝细胞肝癌和混杂肝内胆管癌的乏氧坏死组织区域呈现出强阳性结合，在肝癌组织微血管匮乏的氧供不足区域也呈强阳性结合，从而综合表现出乏氧特异的结合谱症。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种肝癌乏氧表型特异的分子标志物PKM2，以及肝癌乏氧诊断试剂盒，以及该肝癌乏氧分子标志物和肝癌乏氧诊断试剂盒在肝癌乏氧表型高危人群的筛选、肝癌乏氧水平诊测、肝癌乏氧靶向治疗及状况监测、肝癌乏氧指导用药的监测及肝癌乏氧治疗预后检测等领域的应用。根据本专利技术的一个方面，研究发现PKM2在肝癌组织样本中乏氧坏死区(或微血管匮乏区)含量比肝癌组织非坏死区(或微血管丰富区)和正常肝组织样本中的含量显著高，显示PKM2高表达与肝脏肿瘤的乏氧休眠水平存在着密切的相关性。因此，本专利技术提出PKM2作为肝癌乏氧的特异分子标志物，并提供含有该肝癌分子标志物PKM2的诊断试剂盒，以及该分子标志物或诊断试剂盒在肝癌乏氧诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。本专利技术提供的肝癌乏氧的特异分子标志物PKM2，是一种激酶蛋白，其编码基因的核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>2所示。本专利技术的另一目的在于基于上述基因和多肽序列，配合其它检测试剂或治疗药物，在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧表型的肝脏肿瘤药物中的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及前述的肝癌乏氧特异分子PKM2的基因或多肽序列作为标志物在制备肝癌乏氧高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，是通过检测被试者组织样本、血液、胆汁和尿液中的PKM2蛋白的含量，并与正常水平PKM2含量相比较，以进行肝癌乏氧高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。前述的肝癌乏氧分子标志物PKM2的基因或多肽序列作为标志物在制备肝癌乏氧高危人群筛选、诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，可把被试者血清、尿液、胆汁和组织样本中PKM2的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测。前述的诊断肝癌乏氧的诊断试剂盒包括：(1)组织样本、血液、胆汁和尿液中总RNA提取试剂；每20mg组织或200ul血液或400ul尿液100ul胆汁，使用：组分使用量(毫升)Trizol1氯仿0.2异丙醇0.575％乙醇1(2)反转录试剂；组分每个反应体系使用量(微升)5 X primescript buffer2primescript RT enzyme mix I1Oligo dT primer(50uM)0.5PKM2 RT primer0.5RNase free dH2O补齐至10(3)定量PCR试剂；引物包括PKM2和GPDH对照，共2对引物；(4)正常健康人体肝脏组织cDNA(PKM2反转录引物反转录)作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。前述的诊断肝癌乏氧的诊断试剂盒结果分析时检测样本和阴性对照间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，判为标本检测阳性。前述检测试剂盒所用对照为GPDH，其引物序列如下：GPDH上游引物序列：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′(SEQ ID NO.3)GPDH下游引物序列：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′(SEQ ID NO.4)。前述检测试剂盒所检测PKM2，其引物序列如下：PKM2上游引物序列：5′-ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA-3′(SEQ ID NO.5)PKM2下游引物序列：5′-TGGGTGGTGAATCAATGTCCA-3′(SEQ ID NO.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肝癌乏氧表型分子标志物，是一种细胞内丙酮酸激酶转录变异体PKM2，其编码基因具有序列表<400>1的序列。
【技术特征摘要】
1.一种肝癌乏氧表型分子标志物，是一种细胞内丙酮酸激酶转录变异体PKM2，其编码基因具有序列表<400>1的序列。2.由权利要求1基因编码的多肽产物，其具有序列表<400>2的序列。3.一种肝癌乏氧检测诊断试剂盒，其特征在于含有肝癌乏氧表型分子标志物PKM2，其蛋白质的氨基酸序列为<400>2所示，其基因的核苷酸序列为<400>1所示。4.根据权利要求3所述的肝癌乏氧检测诊断试剂盒，其特征在于包括：(1)组织样本、血液、胆汁和尿液中总RNA提取试剂(2)反转录试剂(3)定量PCR试剂，引物为PKM2和对照GPDH两对引物，其中：对照GPDH的上游引物序列如<400>3所示，对照GPDH的下游引物序列如<400>4所示。检测PKM2的上游引物序列如<400>5所示，检测PKM2的下游引物序列如<40...
【专利技术属性】
技术研发人员：张思河，张青，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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