改良的色素上皮衍生因子变体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及色素上皮衍生因子（ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ，ＰＥＤＦ）的抗血管生成变体及其用途，其中所述变体包含多个被改变的磷酸化位点、编码所述位点的多核苷酸。尤其，本发明专利技术的ＰＥＤＦ变体提供优良的抗血管生成活性和高神经营养活性，可用于治疗与新血管形成和神经变性病状关联的疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF )的抗血管生成变体及其用途，其中所述变体包含多个被改变的磷酸 化位点、编码所述位点的多核苷酸。尤其，包含多个被改变的磷酸化位点 的PEDF变体4是供优良的抗血管生成活性和高神经营养活性，可用于治疗 与新血管形成和神经变性病状关联的疾病。
技术介绍
色素上皮衍生因子(PEDF)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员，但 是到目前为止，没有发现其呈现出对任何蛋白酶的抑制活性。最初，基于 它把分裂的眼癌细胞转化成分化型神经元的能力而把它离析出来，因此将 它鉴定为神经营养因子。后来发现，除了其神经营养功能之外，PEDF还 是眼睛中血管生成的有效天然抑制剂，在眼睛中它抑制几种强的促血管生 成因子的刺激活性。这一抗血管生成的潜能也已经在一些动物才莫型中表现 出来，其中例证了 PEDF为负责减少眼睛中血管生长的因子。尽管最初在 从胎儿的人类视网膜获得的色素上皮细胞的培养基中发现PEDF,但目前 清楚，PEDF不只在视网膜中也在成人眼睛的多个位点以及成年人类的脑、 脊髓和人类血浆中祐束达。因此，PEDF可能具有抑制全身血管生成的潜 能。已经确定，蛋白质磷酸化在大部分细胞内过程的调节中扮演主要角 色。然而，越来越明显，蛋白质激酶也可调节细胞外过程，因为它们在细 胞外作为外部蛋白质(ecto-protein)激酶或外蛋白质(exo-protein)激酶存 在。外部蛋白质激酶是膜结合酶，其催化活性位于多种细胞的胞外细胞表8面。外蛋白质激酶是分泌的可溶酶，其催化活性存在于胞外环境中，与细 胞无直接关联。这些蛋白质激錄被示出为磷酸化细胞外可溶底物和细胞表 面蛋白质，因此在包括细胞-细胞的相互作用、分化、增殖和离子流在内的 许多生理学过程中起调节作用。本专利技术的诸专利技术人在他们的最近研究中已经显示，从人类血浆(plPEDF)提纯而来的PEDF是一种磷蛋白质，该磷蛋白质在循环中被酪 蛋白激酶CK2 ( CK2 )和蛋白质激酶A (PKA)磷酸化(Maik-Rachline G., 等.Blood. 105:670-678， 2005 )。还显示，CK2在两个主要残基Ser24和 Serll4上磷酸化PEDF，而PKA在Ser227上磷酸化PEDF。使用几种模拟 磷酸(Ser到Glu)或非磷酸(Ser到Ala)形式的PEDF的磷酸化位点突 变体，发现PEDF的CK2和PKA磷酸化各自显著地影响它的生理机能。 CK2磷酸化的PEDF具有降低了的神经营养活性，而其抗血管生成活性显 著地增加。另一方面，PKA磷酸化P争低了 PEDF抗血管生成活性，但对它 的神经营养活性几乎没有影响(Maik-Rachline G.,等.Blood. 2005, 105:670-678 )。在本专利技术申请人的国际申请公布第WO 2006/054278号中，揭示了 一 种PEDF变体以及另 一种PEDF变体，其中第一种PEDF变体把在PEDF 的CK2磷酸化位点上的两个丝氨酸残基即丝氨酸24和丝氨酸114置换成 带负电荷的氨基酸，它与重组野生型PEDF相比较具有更高的抗血管生成 活性而具有更低的神经营养活性，第二种PEDF变体把在PKA磷酸化位点 上的丝氨酸残基即丝氨酸227置换成带负电荷的氨基酸，它与重组野生型 PEDF的相比较表现出更低的抗血管生成活性而表现出相似的神经营养活 性。WO 2006/054278要求保护包含至少一个被改变的磷酸化位点的抗血管 生成PEDF变体。WO 2006/054278进一步要求保护编码抗血管生成PEDF 变体的离析多核苷酸及其使用方法。美国专利第5,840,686号揭示了编码PEDF、被截断的PEDF及等效 蛋白质的核酸，用于产生重组PEDF、 一皮截断的PEDF和等效蛋白质的重 组方法，以及这些蛋白质在神经元分化、神经元生存和神经胶质抑制中的 用途。美国专利第6,319,687号要求保护重组PEDF蛋白质和具有PEDF生9物活性的PEDF截断形式。国际申请公布第WO 03/059248号揭示了呈现有效的抗血管生成和神 经营养活性的人类血浆PEDF。国际申请公布第WO 2004/028559号揭示了基本由PEDF的5到50个 邻接tt酸组成的PEDF片段、包含所述PEDF片段的药物組合物及其用 于治疗癌症或眼科疾病的用途。美国专利申请第2005/0222031号揭示了用于预防或治疗恶性黑色素 瘤的方法，该方法包括为有相应需要的患者施用PEDF或具有功能上与 PEDF等效特性的PEDF变体。根据美国专利申请第2005/0222031号，PEDF 变体包含改变人类PEDF的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，并具有功能上与人类PEDF等效特性的tt酸序列。然而，在美国专利申请第 2005/0222031号中，既没有揭示被改变的氨基酸残基的位点和数量，也没 有揭示氨基酸改变对PEDF生物活性的影响。美国专利第6,821,775号揭示了一种复制缺陷型腺病毒载体，它含有 编码PEDF或其治疗性片段的核酸序列。尽管包含置换、缺失或添加并编 码功能性PEDF肽或其治疗性片段的核酸序列适宜插入病毒载体中，但是 美国专利第6,821,775号并没有揭示能够发挥出比PEDF更优活性的具体 PEDF变体。美国专利申请公开第2003/0158112号揭示了一种治疗脉络膜新血管 形成的方法，包含直接对眼睛施用治疗性因子或编码治疗性因子的核酸序 列，以选择性地诱导与脉络膜新血管形成相关联的内皮细胞的凋亡，从而 治疗脉络膜新血管形成。所列出的治疗性因子包括PEDF或其片段。在美 国专利申请公开第2003/0158112号中，对于在特定位点有氨基酸置换的 PEDF变体，没有指出这些变体可用于治疗脉络膜新血管形成。国际申请公布第WO 05/041887号揭示了用于治疗涉及增加的血管通 透性的病状的方法，该方法包括施用PEDF或PEDF44氨基酸肽或其同系 物，其中分别在位点IOI、 103、 112和115的氨基酸残基谷氨酰胺、异亮 氨酸、亮氨酸和丝氨酸不被改变。在国际公布申请第WO 05/041887号中没有揭示包含在位点24、 114和227被置换的丝氨酸残基的PEDF变体 可用于治疗涉及增加的血管通透性或增加的血管生成的病状。仍然存在对表现出神经营养活性的PEDF的有效抗血管生成变体的、 没有得到满足的需求。专利技术概述本专利技术提供了新颖的抗血管生成PEDF变体，它包含相对于人类PEDF 氨基酸序列SEQIDNO:l被改变的氨基酸序列，其中该被改变的氨基酸序 列包含多个被改变的磷酸化位点。尤其，本专利技术提供了新颖的抗血管生成 PEDF变体，它包含相对于人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO:l被改变的 tt酸序列，其中该被改变的氨基酸序列包含在丝氨酸24、丝氨酸114和 丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。本专利技术进一步提供编码该新颖 PEDF变体的离析多核苷酸、含有所述变体的药物组合物及其使用方法。 本专利技术进一步提供针对所述PEDF变体的离析抗体。出乎意料的是，现在揭示，在位点24、 114和227包含三个带负电荷 的氨基酸残基、替换在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗血管生成色素上皮衍生因子（ＰＥＤＦ）变体或其类似物或融合蛋白，其包括具有多个被改变的磷酸化位点的人类ＰＥＤＦ氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的变体或其片段，条件是：所述变体不同于仅由两个在丝氨酸２４和丝氨酸１１４处被改变的磷酸化位点组成的ＰＥＤＦ变体、其类似物、片段或融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：加利亚麦克瑞茨琳尼，罗尼塞格，
申请(专利权)人：维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]