本发明专利技术公开了一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质及其应用。本发明专利技术利用Strep-tag多肽可与负载有Strep-Tactin蛋白的基质相结合的特性，可在不同基质表面连接多肽。将生物靶向分子进行化学衍生形成生物分子-Strep-tag偶联物，通过Strep-tag与Strep-Tactin的特异性识别作用将生物分子-Strep-tag偶联物固定于基质表面。加入生物素后，生物素与Strep-Tactin的竞争结合会破坏生物分子与基质的连接，从而实现对待测物的可逆捕获和释放。本发明专利技术制备及使用过程简单、快速，并且重复性好，可广泛用于肿瘤标志物检测、细胞捕获和释放等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物、化学及材料科学领域，涉及一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质及其应用。
技术介绍
Strep-tag纯化系统是基于Strep-tag多肽和特殊设计的Strep-Tactin（streptavidin的变体）之间高选择性和极易控制的相互作用而建立起来的蛋白纯化系统，其技术开发的原理是生物素（biotin）和链霉亲和素（streptavidin）之间的结合反应。Strep-tag多肽包含Strep-tag I和Strep-tag II，它们对Strep-Tactin的结合亲和力比对streptavidin高。在亲和纯化过程中，附了tag的蛋白质结合在被固定了的Strep-Tactin上。短暂的洗涤步骤之后，在同一缓冲液中加入特异性竞争剂生物素即可将纯化的重组蛋白温和地洗脱下来。该系统具有简单、易使用、可在生理条件下进行竞争性洗脱等特点，已被广泛应用于蛋白质混合物的分离纯化及鉴定领域。但目前这一系统并未运用于循环肿瘤细胞的捕获及释放，限制了其应用范围。循环肿瘤细胞是进入外周血的肿瘤细胞，其检测可有效地应用于体外早期诊断及个性化治疗等。循环肿瘤细胞的无损分离、捕获和再培养可以为循环肿瘤细胞的基因和蛋白质分析提供研究基础。但由于肿瘤细胞具有数量稀少及异质性等特点，因此需要发展能高效分离肿瘤细胞的方法。目前，针对于循环肿瘤细胞捕获及释放的方法有较多报道，但往往存在缺乏特异性、探针制备过程繁琐、操作过程复杂、捕获及释放过程对细胞有较大损伤等问题，关于循环肿瘤细胞的无损分离及体外培养仍较少被报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质及其在细胞的捕获及释放中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质为将Strep-tag多肽标记的生物分子固定在负载有Strep-Tactin蛋白的基质上得到。所述的Strep-tag多肽包括Strep-tag I（含九个氨基酸，其序列为Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly）、Strep-tag II（含八个氨基酸，其序列为Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）及其相关的衍生物和类似物。所述的生物分子包括抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体等可以对细胞、蛋白、核酸、生物小分子进行特异性识别和捕获的蛋白或核酸。所述的Strep-tag多肽标记的生物分子为偶联Strep-tag多肽的生物分子（生物分子-Strep-tag偶联物）。当生物分子为抗体时，Strep-tag多肽标记的抗体优选通过包含如下步骤的方法制备得到：通过高碘酸钠或高碘酸钾将抗体Fc端的糖残基氧化成醛基后与Strep-tag多肽上的氨基反应得到Strep-tag多肽标记的抗体。当生物分子为除抗体外的链霉亲和素、凝集素、生长因子或核酸适配体等生物分子时，所述的Strep-tag多肽标记的生物分子优选通过包含如下步骤的方法制备得到：通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC·HCl）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）活化链霉亲和素、凝集素、生长因子或核酸适配体等生物分子的羧基，再与Strep-tag多肽的氨基连接得到Strep-tag多肽标记的生物分子。所述的负载有Strep-Tactin蛋白的基质为商品化负载有Strep-Tactin的磁珠或商品化含Strep-Tactin的树脂球、孔板等，也可将Strep-Tactin蛋白修饰于任一种基质上。当可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质中的生物分子为链酶亲和素时，还可以将另外一种生物分子生物素化后通过与链酶亲和素的作用固定在负载有Strep-Tactin蛋白的基质上。本专利技术通过将Strep-tag多肽连接生物分子制得Strep-tag多肽标记的生物分子；再利用Strep-tag多肽可与负载有Strep-Tactin蛋白的基质相结合的特性，将多肽标记的生物分子固定于基质表面，制得具有优异生物靶向性的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质。将生物素与Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质孵育，生物素与Strep-Tactin的竞争结合会破坏生物分子与基质的连接，从而实现对待测物的可逆捕获和释放。上述Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质可用于细胞的捕获及释放。当生物分子为抗体，在制备多肽标记的抗体衍生化基质用于细胞的捕获和释放时，可以通过以下两种方式：先将二抗通过高碘酸钠或高碘酸钾氧化，然后与Strep-tag多肽连接获得多肽标记的二抗，再通过二抗与一抗的作用固定可以用于细胞识别的一抗；也可以直接将一抗通过高碘酸钠或高碘酸钾氧化，然后与Strep-tag多肽连接获得多肽标记的一抗，用于细胞的捕获。一种Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质用于细胞的捕获及释放的方法，包括如下步骤：（1）将Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质与细胞混合并孵育后分离，提取特异性捕获细胞的基质。（2）将特异性捕获细胞的基质与生物素或其衍生物（如脱硫生物素代替）混合后孵育，提取释放后的细胞进行后续分析。优选的，一种Strep-tag多肽标记的抗体衍生化基质用于细胞捕获及释放的方法包括如下步骤：（1）将5～1000μg/mL的抗体与20mM高碘酸钠或高碘酸钾按照体积比1:1混合，孵育0.5～2小时后，通过高碘酸钠或高碘酸钾将抗体Fc端的糖残基氧化成醛基，将所得物超滤洗涤，提取氧化的抗体。（2）将0.1～100mg/mL的Strep-tag多肽与步骤（1）得到的氧化的抗体按照摩尔比1～50:1（多肽:抗体）混合，孵育0.5～8小时后，Strep-tag多肽上的氨基与抗体的醛基形成酰胺键，将所得物超滤洗涤，提取Strep-tag多肽标记的抗体。（3）将0.1～100mg/mL步骤（2）得到的Strep-tag多肽标记的抗体与浓度为0.1～200mg/mL的商品化负载有Strep-Tactin的磁珠按照体积比1:0.1～50混合并孵育0.5～8小时后，将所得物充分洗涤分离，提取Strep-tag多肽标记的抗体衍生化磁珠。（4）将Strep-tag多肽标记的抗体衍生化磁珠与细胞混合，孵育5～45min后分离，提取特异性捕获细胞的磁珠。（5）将特异性捕获细胞的磁珠与生物素或其衍生物（如脱硫生物素代替）混合后，孵育5～45min，提取释放后的细胞进行后续分析。本专利技术具有如下优点和效果：本专利技术制备的多肽标记的生物分子衍生化基质具有优异的生物靶向性。将生物素与多肽标记的生物分子衍本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可逆组装和分解的Strep‑tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：通过将Strep‑tag多肽标记的生物分子固定于负载有Strep‑Tactin蛋白的基质上得到。
【技术特征摘要】
1.一种可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：通过将Strep-tag多肽标记的生物分子固定于负载有Strep-Tactin蛋白的基质上得到。
2.根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：
所述的Strep-tag多肽包括Strep-tag I、Strep-tag II及其相关的衍生物和类似物；
所述的生物分子为对细胞、蛋白、核酸、生物小分子进行特异性识别和捕获的蛋白或核酸，包括抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体。
3.根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：所述的Strep-tag多肽标记的生物分子为偶联Strep-tag多肽的生物分子。
4.根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：
当生物分子为抗体时，Strep-tag多肽标记的抗体通过包含如下步骤的方法制备得到：通过高碘酸钠或高碘酸钾将抗体Fc端的糖残基氧化成醛基后与Strep-tag多肽上的氨基反应得到Strep-tag多肽标记的抗体；
当生物分子为除抗体外的生物分子时，所述的Strep-tag多肽标记的生物分子通过包含如下步骤的方法制备得到：通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺活化链霉亲和素、凝集素、生长因子或核酸适配体的羧基，再与Strep-tag多肽的氨基反应得到Strep-tag多肽标记的生物分子。
5.根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：所述的负载有Strep-Tactin蛋白的基质为商品化负载有Strep-Tactin的磁珠或商品化含Strep-Tactin的树脂球、孔板，或将Strep-Tactin蛋白修饰于其他基质上。
6.根据权利要求1所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质，其特征在于：所述的可逆组装和分解的Strep-tag多肽标记的生物分子衍生化基质中的生物分子为链酶亲和素时，将另外一种生物分子生物素化后通过与链酶亲和素的作用固定在负载有St...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄卫华，陆宁宁，谢敏，程世博，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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