改良的重组人类精氨酸I表达系统技术方案

本发明专利技术提供一种用以改善重组人类精氨酸酶Ⅰ表达的新重组蛋白表达系统。所述系统包含一用以改善重组人类精氨酸酶Ⅰ表达的分离和纯化核酸分子以建构质粒和大肠杆菌种。在另一方面，本发明专利技术提供一种生产分离的大肠杆菌种的方法用以表达所述精氨酸酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人类精氨酸酶I的克隆。特别地，本专利技术涉及对应于所 述人类精氨酸酶I的核酸分子和质粒。本专利技术还涉及一种用以表达所述 人类精氨酸酶I的重组蛋白的大肠杆菌。本专利技术还涉及一种生产重组蛋 白的方法。
技术介绍
重组工序是利用基因工程生物去生产有医药用途的蛋白。好些例 子如胰岛素，生长激素和疫苗就是重组工序的产品。上述的蛋白可以 在工厂里大量地以大桶的基因工程细菌来生产。在重组工序中，最普 遍使用的生物是大肠杆菌。相比于其它生物，我们大概对于细菌的生理和基因更为了解得多。 然而， 一个工序的成功与否通常依靠所述用基因工程技术制作的细菌 的存活率和所述带有重要讯息以制做最后成品的重组脱氧核糖核酸。 建构差劣的质粒可能不能够产生有意义数量的成品但同时降低所述用 基因工程技术制作的细菌的存活率。而且，亦会有产生难以剔除的污 染物和损害最终成品质量的风险。
技术实现思路
基于上述原因，本专利技术目的是提供一个更好的基因工程技术制作 的细菌以生产人类精氨酸酶I，从而扩大所述精氨酸酶的产量，令所述 方法安全及有效地制造出符合药品生产质量管理规范的材料。因此，在一方面本专利技术是一分离并纯化的核酸分子用以表达重组 人类精氨酸酶I。在本专利技术的一优选实施例是使用所述核酸分子以建构用以表达重 组人类精氨酸酶I的质粒。在另一方面，本专利技术是使用所述质粒以建构一分离品种的大肠杆 菌，用以制做重组人类精氨酸酶I。附图说明图1显示从已转化的感受态DH5(a)大肠杆菌细胞中萃取的质粒 pET30(+)/ARGC的琼脂糖电泳分析。萃取后的pET30(+)/ARGC以限制 性内切酶NdeI和XhoI酶解。预期中大小为1.4kb和5kb的片段显现。 Lane M:XDNA/EcoRI+Hindm标记(MBI);Lanel:以Ndel和Xhol双重酶 解后的pET30a(+)/ARGC;Lane2:未经酶解的pET30a(+)/ARGC。图2显示包含1,383个核酸的重组pET30(+)/ARGC中的插入核苷 酸序列。图3显示从已转化的感受态DH5(a)大肠杆菌细胞中萃取的质粒 pET30(+)/ARGM的琼脂糖电泳分析。萃取后的pET30(+)/ARGM以限 制性内切酶Ndel和Xhol酶解。预期中大小为lkb和5kb的片段显现。 Lane M:ADNA/EcoRI+Hind111标记(MBI);Lanel:以Ndel和Xhol双重酶 解后的pET30a(+)/ARGM;Lane2:未经酶解的pET30a(+)/ARGM。图4显示包含993个核酸的重组pET30(+)/ARGM中的插入核苷酸 序列，其中包括2套终止密码子TAA。图5显示由pET30a(+)/ARGM的核苷酸序列中的993个核酸编码 区域推论出的蛋白序列。所述已表达的人类精氨酸酶I蛋白是一 322 氨基酸残基加上起始的甲硫氨酸和6个组氨酸标记的蛋白，或总共329 氨基酸残基。图6显示所述以BL21(DE3)表达的pAED-4/ARGC的SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳分析。Lane M:低分子量蛋白标记;Lanel:没有IPTG诱导 的重组人类精氨酸酶I; Lane2:诱导后一小时;Lane3:诱导后2小时;Lane4: 诱导后3小时;Lane5:诱导后4小时;Lane6:诱导后5小时。图7显示所述以BL21(DE3)表达的pET30a(+)/ARGC的SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析。Lane M:低分子量蛋白标记；Lanel:没有IPTG诱 导的重组人类精氨酸酶I; Lane2:诱导后一小时;Lane3:诱导后2小 时;Lane4:诱导后3小时;Lane5:诱导后4小时;Lane6:诱导后5小时。图8显示所述以BL21(DE3)表达的pET30a(+)/ARGM的SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析。Lane M:低分子量蛋白标记;Lane P邻人类精氨酸 酶I; Lanel:没有IPTG诱导的重组人类精氨酸酶I; Lane2:诱导后一小 时;Lane3:诱导后2小时;Lane4:诱导后3小时;Lane5:诱导后4小 时;Lane6:诱导后5小时。具体实施方式实施例1:建构pET30a(+)/ARGC质粒pET30a(+)/ARGC质粒可用基因克隆领域中的普通实验技巧制备。 首先，pAED-4/ARGC质粒和pET30a(+)质粒独立地分别以限制性内切 酶Ndel和Xhol在37°C中酶解过夜。然后，已酶解的片断与T4DNA 连接酶在16°C中混合过夜。所述己连接的质粒转化进感受态DH5(a) 大肠杆菌细胞内。在包含30ug/ml卡那霉素的LB plate中进行筛选。挑 选单一菌落并培养。所述已连接质粒以限制性内切酶Ndel和Xhol在 37°C中酶解一小时萃取，并以电泳方法核实。最后，所述已连接并萃 取的质粒，当中包含一 pET30(+)骨干和所述人类精氨酸酶基因(包含非 编码序列)被命名为pET30(+)/ARGC。所述核酸序列经Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd.(Shanghai)核实。如图2所示，所述核酸序列与理 论上的序列完全相同，其包含1,383核酸。实施例2: pET30a(+)/ARGC质粒的表达所述已建构的pET30a(+)/ARGC在包含30jag/mL卡那霉素的LB 培养碟中用以转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌细胞。经过12小时的生 长时间后，挑选单一菌落并转移至50mLLB培养基。所述细胞在37°C， 250rpm中发酵。当OD,是0.6到0.8时，加入IPTG使浓度达到0.4mM 以诱导细胞进行表达。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试表达水平。实施例3:建构pET30a(+)/ARGM质粒如下所示的两个引物(SEQ ID NO.l和2)，是设计为利用限制性内 切酶Ndel禾卩Xhol建构pET30a(+)/ARGM质粒所用1-F :5 ，-GGAATTCC ATATGCATC ACCATC ACCATCAC-3' 2画R:5，-CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGTCAA TAG隱3pET30a(+)/ARGM质粒可用基因克隆领域中的普通实验技巧制备。 首先，以pAED-4/ARGC质粒作为模板用PCR(聚合酶链锁反应)技术扩 增pAED-4/ARGC质粒。所述己扩增的基因片段和pET30a(+)质粒独立 地分别以限制性内切酶Ndel和XhoI在37。C中酶解过夜。然后，已酶 解的片断与T4DNA连接酶在16°C中混合过夜。所述己连接的质粒转 化进感受态DH5(a)大肠杆菌细胞内。在包含30ug/ml卡那霉素的LB plate中进行筛选。挑选单一菌落并培养。所述已连接质粒以限制性内 切酶Ndel和XhoI在37。C中酶解一小时萃取，并以电泳方法核实。最 后，所述已连接并萃取的质粒，当中包含一 pET30(+)骨干和所述人类 精氨酸酶基因(不包含非编码序列)被命名为pET30a(+)/ARGM。所述核 酸序列经Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd.(Shanghai)核实。如图4所 示，所述核酸序列与理论上的序列完全相同，其包含993核酸。实施例4: pET3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达重组人类精氨酸酶Ⅰ的分离和纯化的核酸分子，其中所述核酸分子包括人类精氨酸酶Ⅰ的编码序列和一可操作地与之连接的预先设定的启动子序列，所述启动子序列刺激一预先设定的表达系统表达所述人类精氨酸酶Ⅰ，其中所述核酸序列不包括人类精氨酸酶Ⅰ　ｍＲＮＡ的非编码序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄予良，先宗树，
申请(专利权)人：康达医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]