本发明专利技术涉及蛋白质及蛋白质组在制备肝硬化诊断试剂中的应用，蛋白质包括基膜聚糖蛋白(Lumican)、四连接素(Tetranectin)、亲血小板碱性蛋白(Pro-platelet?basic?protein，PBP)、色素上皮衍生因子(Pigment?epithelium-derived?factor，PEDF)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like?growth?factor?binding?protein，IGFbp-3)、性激素结合球蛋白(Sex?hormone-binding?globulin，SHBG)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)以及部分的组合在肝硬化诊断试剂中的应用。本发明专利技术采用蛋白质组技术，大范围鉴定和评估与健康和疾病状态相关的多种蛋白质，使用这些筛选鉴定肝炎肝纤维化的生物标志物来预测肝炎肝纤维化的程度，可用于制备诊断肝硬化及肝硬化级别的试剂盒，这些蛋白质标记物鉴定肝纤维化及其程度的灵敏度，结合各蛋白质标记物的最佳状况，灵敏度可达89％，特异性达90％以上，高于已知的任何检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利属于检测试剂领域，尤其是一种蛋白质及蛋白质组在肝硬化诊断试剂中的应用。
技术介绍
肝硬化(Liver cirrhosis)是一种常见的慢性肝病，可由一种或多种原因引起肝脏损害，肝脏呈进行性、弥漫性、纤维性病变。具体表现为肝细胞弥漫性变性坏死，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生，这三种改变反复交错进行，结果肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，使肝变形、变硬而导致肝硬化。该病早期无明显症状，后期则出现一系列不同程度的门静脉高压和肝功能障碍，直至出现上消化道出血、肝性脑病等并发症死亡。引起肝硬化的病因很多，不同地区的主要病因也不相同。欧美以酒精性肝硬化为主，我国以肝炎病毒性肝硬化多见，其次为血吸虫病肝纤维化，酒精性肝硬化亦逐年增加。研究证实，两种病因先后或同时作用于肝脏，更易产生肝硬化，如血吸虫病或长期大量饮酒者合并乙型病毒性肝炎等。肝炎病毒是慢性肝炎的重要原因，是肝硬化的主要原因，是肝癌和肝移植的最常见的原因。病毒性肝炎患者有不同的转归，其中一部分将发展为肝炎后肝硬化， 2002年全球的死亡率预测数据显示，92. 9万人死于慢性乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染所致的肝病，其中包括44. 6万人死于肝硬化(HBV相关者23. 5万，HCV相关者 21. 1万)，肝硬化是正常肝组织结构的破坏，特征是形成放射状无功能瘢痕组织围绕有功能的肝组织。肝损伤最常见的结局是肝硬化，在美国，肝硬化最常见的原因是酗酒，在45 65岁的人群中，肝硬化排到死因的第三位，仅次于心脏疾病与癌症。在大多数亚非国家，慢性肝炎是肝硬化的主要原因。肝硬化通常是进行性的，如早期酒精性肝硬化病人停止酗酒， 肝内瘢痕增生可停止，但已形成的瘢痕组织不会改变，因此，早期诊断，早期治疗尤为重要。长期以来，经皮肝穿刺活检病理结果是肝纤维化分期的最终标准，但肝穿刺为有创操作，存在取样误差、观察偏倚等局限性，肝穿取样组织只占整个肝脏的五万分之一，加之纤维化分布不均勻，导致肝穿刺活检存在取样误差(10% -45% )，非常影响准确性，此外，静态病理学表现常难以与动态的组织学改变同步，局部取材亦难以反映肝脏的整体改变，且反复穿刺往往是患者不易接受而难以随访的。因此，经皮肝穿刺活检难以推广为肝纤维化动态评估的常规方法。采用简单、无创、可重复的方法对肝纤维化进行评估，以监测疾病进展、临床预后、治疗反应及逆转肝纤维化药物的疗效，是临床上需要的。将来肝穿刺对诊断不明原因的肝病仍具重要价值，但新的无创检查方法，如血清学生物标志物的检测和弹性扫描等，用于评估和判断酒精性和病毒性肝病的肝纤维化程度，有可能替代肝活检。Fibrospect是一项新颖、无创、无痛、快速和客观的诊断肝纤维化的方法。由于Fibrospect局限性，目前还没有建立统一的诊断纤维化分期的标准，原则上就需要建立不同人群的界定值来评估肝纤维化的分期。FT(FibroTest)在区分严重和轻微/ 无纤维化病例时准确度优于肝活检，但对纤维化程度介于其间者无明显优势。蛋白质组技术已被用来识别特定疾病或疾病阶段的蛋白标志物。早期的结果为肝脏疾病标志物寻找已报告。血清，去除血浆凝血因子，包含除了各种小分子，如盐，脂肪，氨基酸和糖含蛋白60-80毫克/毫升。据估计，整个血清中含有多达10，000种来源于细胞和组织的蛋白质，由于肝脏是其主要来源，血清蛋白质可能反映肝脏疾病。蛋白质组学技术已被开发，以提高蛋白质组进行调查。二维凝胶电泳O-DE)的， 一个典型的方法分离和比较复杂的蛋白质混合物，在其基础上建立的荧光差异蛋白表达分析系统(DIGE)。DIGE在传统双向电泳技术的基础上，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。 DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上。另一种蛋白质组技术同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)正被广泛应用。iTRAQ 技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达八种不同样本同时进行定量分析。研究人员采用iTRAQ蛋白质定量技术加速蛋白质的定量研究，iTRAQ技术依托于溶液同位素标记体系，利用同位素质量标签对蛋白质进行标记，使具有相同的离子化能力，将标记蛋白质混合起来，应用液相色谱与质谱串联进行分析，可以通过比较质谱峰的强弱得到相对定量的数值。Imbert-Bismut等建立了一个更特异的检测肝纤维化方法(Imbert-Bismut F, Ratziu V, Pieroni L, Charlotte F, Benhamou Y, Poynard Τ. Biochemical markers of liver fibrosisin patients with hepatitis C virus infection -.a prospective study. The Lancet. 2001 ；357 :1069-1075.)。检测丙型肝炎病人一组17种血清标志物 (主要是蛋白质)并同时作肝活检。血清标志物是α2巨球蛋白，谷草转氨酶，谷丙转氨酶，Y谷氨_转，总胆红素，白蛋白，、球蛋白，^球蛋白，Υ球蛋白，β球蛋白，载脂蛋白Al，结合珠蛋白，白细胞介素10，肿瘤生长因子β 1，肝细胞生长因子，载脂蛋白A-II和载脂蛋白B.目前还不清楚这17蛋白的选择标准，但很多是高丰度蛋白质。我们的蛋白组学方法是一种无偏差的方法，因为所有的蛋白质，已知与未知的，都可用DIGE和iTRAQ 进行评价。Imbert-Bismut等用METAMR评分系统评估肝纤维化程度，结合统计分析回归等确定的六个最可靠的标记物为α2巨球蛋白，触珠蛋白，、球蛋白，载脂蛋白Al， Y glutamyltrans-酶和总胆红素。另一组作者认为，通过使用这组基本血清标志物(命名为FibroTest)，可检测肝纤维化，肝活检的患者数量可以大大减少。但迄今为止，独立的验证得出的结论是FibroTest无法准确预测明显存在的肝纤维化。最近有研究者建立了另一个非侵入性的检测慢性丙型肝炎患者的肝纤维化和肝硬化得方法。其指数分别为血小板计数，谷草转氨酶(AST)，碱性磷酸酶和AST与血小板比值指数率(APRI)。然而，其预测肝纤维化的准确率只有51%，证明低于Fibrotest。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种新型、高效、准确率高蛋白质及蛋白质组在制备肝硬化诊断试剂中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的蛋白质亲血小板碱性蛋白(pro-platelet basic protein, PBP)在制备肝硬化诊4断试剂中的应用。蛋白质组性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin, SHBG)、胰岛素样生长因子结合蛋白 3 (insulin-like growth factor binding protein 3, IGFbp-3)、基膜聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．蛋白质亲血小板碱性蛋白在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.蛋白质亲血小板碱性蛋白在制备肝硬化诊断试剂中的应用。2.蛋白质组性激素结合球蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3、基膜聚糖蛋白、色素上皮衍生因子、亲血小板碱性蛋白和硫氧还蛋白在制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜勇，杨靖，
申请(专利权)人：天津宝瑞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：12
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